生活饮用水标准检验方法_微生物指标[1]

生活饮用水卫生标准GB5749-2006生活饮用水标准检验方法GB5750-2006微生物指标及微生物检验的介绍广东省CDC微生物检验所严纪文我国旧的饮用水水质标准是1985年颁布实施的GB5749-85，标准检验方法为GB5750-85。该标准与国外的饮用水标准相比，主要差别在于微生物指标项目少，缺少有机物和消毒副产物指标。微生物指标只有细菌总数和总大肠菌群2项，不能确切的评价水质的卫生状况。修订后的标准，微生物学指标增加为6项：菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫和隐孢子虫。同时在资料性附件中增加了肠球菌和产气荚膜梭状芽胞杆菌。水质常规指标及限值修订前修订后微生物指标限值微生物指标限值细菌总数100CFU/mL菌落总数/（CFU/mL）100总大肠菌群每100mL水样中不得检出总大肠菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出粪大肠菌群每100mL水样中不得检出耐热大肠菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出游离余氯在与水接触30min后应不低于0.3mg/L,管梢末水不应低于0.5mg/L大肠埃希氏菌/（MPN/100mL或CFU/100mL）不得检出水质非常规指标及限值修订前修订后微生物指标限值微生物指标限值-菌落总数/（CFU/100mL）500小型集中式供水和分散式供水部分水质指标及限值修订前修订后微生物指标限值微生物指标限值-贾第鞭毛虫/（个/10L）1-隐孢子虫/（个/10L）1生活饮用水水质参考指标及限值修订前修订后微生物指标限值微生物指标限值-肠球菌/（CFU/100mL）0-产气荚膜梭状芽胞杆/（CFU/100mL）0一、菌落总数修订前修订后细菌总数原理：细菌总数是指水样在一定条件下培养后（培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等）所得1ml水样所含菌落的总数。按本规范规定所得结果只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧的细菌菌落总数培养条件：36±1℃24h菌落总数定义：水样在营养琼脂上有氧条件下37℃培养48h后，所得1ml水样所含菌落的总数。36±1℃48h二、总大肠菌群（埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属）除多管发酵法、滤膜法外，增加了酶底物检测方法多管发酵法修订前修订后多管发酵法原理：总大肠菌群系指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，具有指示菌的一般特征，故以此作为粪便污染指标评价饮水的卫生质量。总大肠菌群定义：总大肠菌群指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。结果：5个10ml管中阳性管数为0时，MPN值为0（主要针对出厂自来水或需每天检验一次的水样）结果：5个10ml管中阳性管数为0时，MPN值2.2滤膜法修订前修订后滤膜法原理：用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样,细菌被截留在滤膜上,将滤膜贴在选择培养上,经培养后,计数生长在滤膜上的典型大肠菌群菌落数。培养条件：37℃18-24h滤膜法定义：总大肠菌群滤膜法是指用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤水样,将滤膜贴在添加乳糖的选择培养上,37℃培养24h，能形成特征菌落的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌以检测水中总大肠菌群的方法。培养条件：37℃24±2h酶底物法酶底物法定义：总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β-半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。培养基：MMO-MUG培养基（MinimalMediumONPG-MUG）。本方法可分为定性和定量。定量法：10管法、51孔定量法培养条件：36±1℃24h能产生β-半乳糖苷酶的细菌群组分解ONPG使培养基呈黄色酶底物法的主要特点：优点：可同时判断水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌检测时间较短，只需18-24h，最长需要28h无需确证试验操作简单，对试验条件和人员要求低缺点：检测成本高总大肠菌群三种方法的比较多管发酵法滤膜法酶底物法时间24-72h24-48h24-28h验证试验需要需要不需要步骤较繁较简便简便特殊设备显微镜显微镜、过滤设备压膜机价格低低较高三、耐热大肠菌群（埃希氏菌属、耐热克雷伯氏菌）检测方法：多管发酵法、滤膜法修订前修订后原理：用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群,称为粪大肠菌群。定义：用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中大肠菌群区分开，在44.5℃仍能生长的大肠菌群,称为耐热大肠菌群。四、大肠埃希氏菌检测方法：多管发酵法、滤膜法、酶底物法大肠埃希氏菌多管发酵法定义：大肠埃希氏菌是指多管发酵法总大肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5℃培养24h产生β-葡萄糖酫酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。培养基：EC-MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖酫酸苷）。培养条件：44.5±0.5℃培养24±2h。紫外灯：波长366nm，功率6W大肠杆菌能产生β-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下产生蓝色荧光滤膜法定义：用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜在含有荧光底物的培养基上培养，能产生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。培养基：NA-MUG培养条件：36±1℃培养4h紫外灯：波长366nm，功率6W酶底物法定义：在选择培养基上能产生β-半乳糖苷酶分解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。培养基：ONPG-MUG结果判定：水样变黄色同时在366nm的紫外光下产生蓝色荧光为阳性。水样未变黄色而有蓝色荧光产生不能判定为阳性。五、贾第鞭毛虫子和隐孢子虫贾第鞭毛虫和隐孢子虫是一类寄生于人和动物体内的肠道原虫，可致人兽共患病。患此病的人和动物从粪便中排出大量的卵(孢)囊污染环境，在地面水和防护差的地下水及处理不良的自来水中都可检出卵(孢)囊。随着社会发展，优质供水势在必行。对一些潜在的危险因素加以限制很有必要。在此基础上，新标准中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测方法。Cryptosporidium隐孢子虫特点:单一细胞原生动物，约3-7m。有微小隐孢子虫、鼠隐孢子虫和贝氏隐孢子虫三种，寄生于人、牛等体内的主要为微小隐孢子虫（C．parvum）。宿主：人类、鸟类、鼠类、爬行类、鱼类感染源:隐孢子虫主要寄生在被感染的动物体肠道内，卵囊通过粪便排出体外污染环境。易感人群：免疫缺陷者（如爱滋患者）、儿童、老人、医务人员等传播方式:以粪-口，手-口途径为主，污染的水源和空气均可传播。Cryptosporidium隐孢子虫生活周期子孢子滋养体Ⅰ型裂殖体裂殖子Ⅱ型裂殖体雌、雄配子体合子成熟卵囊裂殖子Cryptosporidium隐孢子虫(染色后荧光显微镜下)特点:单一细胞原生动物，大小约10-15m，含4对鞭毛和双核。人、动物共染。寄生人体内为蓝氏贾第鞭毛虫Giardialamblia。在不同温度和纬度地区均能发现该病；发达国家感染率为2-5%；发展中国家感染率可高达到20-30%。可引起急慢性腹泻、肠吸收紊乱及延缓儿童的生长发育。传染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人带孢囊全家感染；传播:通过被污染的水和食物经口传播；接触（往往一人带孢囊全家感染）；娱乐用水；旅游。易感人群：3岁以内婴儿；免疫功能受损害者；旅游者。Giardia贾第鞭毛虫重要的动物宿主贾第鞭毛虫在自然界广泛存在，包括两栖动物；鸟类；哺乳动物在内的40多种动物均可成为贾第鞭毛虫的宿主。调查表明，人排出孢囊可使狗、海狸、麝鼠、沙土鼠及大鼠等动物感染。一些生活在水中的动物可被来源于人的贾第鞭毛虫孢囊感染，因此这些动物即使不是主要宿主也可能作为贾第鞭虫的传播媒介。Giardia贾第鞭毛虫两虫感染的特点贾第氏鞭毛虫(Giardia)/隐孢子虫(Cryptosporidium)/感染后无特殊临床症状,无预防疫苗，绝大多数抗生素无效，治疗依赖于自身抵抗力大部份作为源水的江河及水库水等地表水是高危的,大部分地下水都有被地表水污染的潜在危险可以通过被污染的源水而进入供水系统,水源性感染已成为最大的感染源，但孢/卵囊对传统的水处理法中氯化消毒有抗性,氯不能渗透过卵囊，沙滤及膜过滤法也不能完全去除饮用水高温煮沸也并非有效对氯消毒耐受、对热敏感、感染剂量低、感染率高隐孢子虫感染案例1993年在美国威斯康星州的东南部港口城市密尔沃基暴发400,000人被Cryptosporidium感染，4,000人到医院就医，60人死亡。调查显示致病源为处理不慎的饮用水。1996年美国CDC将Cryptosporidium感染列入国家必须申报的传染病名单，2002年将Giardia感染列入国家必须申报的传染病名单—U.S.EPA两虫的检测方法（免疫磁分离荧光抗体法）检测程序：水样过滤洗涤离心免疫磁珠捕获卵囊磁珠与卵囊复合物的分离荧光标记和DAPI染色显微镜检查记述结果报告检测问题：方法操作复杂检出率低无法进行生物活性判定不能进行属、种鉴定价格高IDEXXFilta-Max®手动/自动系统－滤器及滤芯FiltaMaxXpress快速系统-滤器及滤芯过滤器滤芯Filta-Max:滤芯结构（手动/自动法）60层环状海绵:55mmx10mm(18mm中孔)从60cm压缩成3cm螺栓固定Filta-Maxxpress:快速法滤芯结构40层海绵:55mmx10mm(18mm中孔)39层海绵:40mmx10mm(18mm中孔)交互叠放从79cm压缩到3cm螺栓固定水样流向1.水样过滤水样从两侧流经压缩的海绵膜汇集至中孔“两虫”在滤芯表面被捕获滤器连接套件滤器滤芯（过滤模块）洗涤管滤芯置于洗涤管,并将滤芯下部的压缩固定锣栓解除周律性地压缩/扩展海绵滤芯2.洗涤(淘洗)滤芯洗涤(淘洗)装置Filta-Max®手动淘洗装置Filta-Max®自动淘洗装置FiltaMaxXpress快速淘洗装置过滤器500ml锥形离心瓶Filta-Maxxpress快速法淘洗流程滤器（带滤芯）放入淘洗装置淘洗装置连接缓冲液及空气压缩机加4.0巴(58psi)压缩空气按动F1钮2分钟后收集400ml淘洗液快速全自动压缩空气滤器＋滤芯淘洗液收集1.将装有淘洗液样本的500mL离心管置2000g离心力下，离心15min。慢慢地减速，（不能使用制动装置！）以免搅起沉淀物。2.用吸气装置将沉淀物上层8-10mL处的悬浮物小心吸出（吸气装置的真空应小于3.3kPa）。3.离心浓缩4.免疫磁珠捕获捕获原理:标记A抗体的磁珠具有A抗原的C/GDYNALMIX1混合器MPC-1磁极MPC-S磁极5.免疫磁珠与孢（卵）囊复合物的分离60min5min10min染色镜检6.染色及镜检单克隆免疫荧光染色（FA-异硫氰酸荧光素）或DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色荧光显微镜（DifferentialInterferenceContrast,DIC）隐孢子虫贾第鞭毛虫两虫的单抗染色结果隐孢子虫的单克隆抗体染色结果隐孢子虫DAPI染色结果贾第鞭毛虫的单克隆抗体染色结果贾第鞭毛虫DAPI染色结果贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊在荧光镜下的特征1.在镜下可见苹果绿色的孢（卵）囊。2.孢（卵）囊的形状、大小符合描述。3.膜与胞质的对照，膜的荧光要强一些。4.孢（卵）壁的完整性（孢囊可能会失去！）7.结果的计算、报告和检测限每升水中的孢（卵）囊数计算公式：Y=（X×V）/（V1×V2）Y:每升水中的孢囊或卵囊的数目X：计数样本的体积中孢囊或卵囊的数目V：离心后再悬浮的体