3卫生微生物检测方法2016.

1卫生微生物学研究和检测的方法公共卫生学院薛晚利[e-mail]2本章主要内容第一节卫生微生物检测的特点及基本原则第二节卫生指示微生物第三节卫生微生物研究和检测的方法第四节卫生微生物研究和检测方法发展前景3第一节卫生微生物学检测的特点与基本原则检测特点：检测对象：致病、非致病、条件致病微生物标本来源：人体、环境环境中致病微生物数量少，需要特异的检测方法，并且多依靠卫生指示微生物检测原则：样品的采集原则样品的运送原则实验室检验原则4一、样品的采集原则（一）样品必须要有代表性:采样量：满足检测要求采样部位：均匀采样采样时间：便于分析微生物的动态变化采样批号：尽量检测每个批号5（二）避免对样品的污染器材灭菌、无菌操作（三）避免对样品中微生物的杀灭和抑制避免有毒物质的残留和高温影响（四）对样品进行详细的标记这是基本要求（1）所有盛样容器必须有和样品一致的标记。在标记上应记明产品标志与号码和样品顺序号以及其他需要说明的情况。标记应牢固，具防水性，字迹不会被擦掉或脱色。（2）当样品需要托运或由非专职抽样人员运送时，必须封识样品容器。6二、样品的运送原则尽快送检一般3-4h内送检，减少细菌死亡和进一步繁殖带来的影响。如不能及时运送，应根据样品性质采取常温冷暗、0-4℃冰箱、-15℃以下冰箱或冷藏库内保存。注意保护待检的微生物一定的温度加保护剂或去除不利因素运送培养基（运输缓冲液）：如病毒、厌氧菌等7根据生物安全规定，妥善包装待运输的标本进行完善的样品交接必须有样品送检单，与实验室人员逐项核对后交接8三、实验室检验原则1.具有相应的实验室硬件设施WHO对微生物危害性的分级生物安全等级（biosafetylevel,BSL）BSL-1（P1实验室）：检验非致病微生物。BSL-2（P2实验室）：检验一般致病微生物。BSL-3（P3实验室）：可检验特殊危险致病微生物。BSL-4（P4实验室）：可检验危害性最严重的病原体。世卫组织感染性微生物的危险度等级分类•危险度等级一级无或极低的个体和群体危险不太可能引起人或动物致病的微生物•危险度等级二级个体危险中等，群体危险低病原体能引起人或动物的疾病，但不太可能对实验室工作人员、社区、牲畜或环境造成严重危害。实验室暴露也许会引起严重感染，但是•对感染有有效的预防和治疗措施•感染传播的危险有限世卫组织感染性微生物的危险度等级分类•危险度等级三级个体危险高，群体危险低病原体通常能引起人或动物的严重疾病，但一般不会发生感染个体向其他个体的传播对感染有有效的预防和治疗措施•危险度等级四级个体和群体的危险均高病原体通常能引起人或动物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播一般没有有效的预防和治疗措施BSL-1•不太可能引起人类疾病或兽医学意义的无疾病•安全措施：参照标准微生物学安全操作（=标准预防措施）。•预期的安全设备：不需要，所以也不需要生物安全柜•实验室设备要求：需要开放实验台和水槽。BSL-2•对群体中出现的中等危险和人类疾病有关系的的微生物。•危险性在于皮肤损伤、摄食、黏膜暴露。•这一防护级别代表的微生物为：金黄色葡萄球菌、沙门菌、轮状病毒、甲型流感病毒、麻疹病毒等。•安全措施：参照一级生物安全实验室操作，+进入受限生物危害警告标志“锐器”防范措施清除污染生物安全手册•预期的安全设备：在操作产生喷溅或气溶胶的感染微生物时，使用验收过的物理防护设备，如I级或II级生物安全柜。BSL-2•PPE（个体防护装备）：根据需要穿戴实验室大褂、手套和面部保护用具。•实验室设备要求：需要开放实验台、水槽和高压灭菌器。BSL-2高压灭菌器洗眼器BSL-2•对本地或外来的呼吸传播微生物（气溶胶）以及可能引起严重的或潜在致命感染的微生物。•这一防护级别代表的微生物为：结核杆菌、炭疽杆菌、霍乱弧菌、高致病性禽流感病毒、黄热病病毒、艾滋病病毒等。•重视环境和实验室人员的保护屏障。BSL-3•安全措施：参照二级生物安全实验室操作，+进入控制全部废弃物均清除污染实验室服装在洗熨前须清除污染免疫血清基线•预期的安全设备：对于所有开放性微生物操作使用I级或II级生物安全柜。BSL-3•PPE（个体防护装备）：根据需要穿戴实验室大褂、手套和呼吸器。•实验室设备要求：二级生物安全实验室要求+实验室与公共走廊通道在物理上分开门自动关闭，双门入口排出废气不可再循环实验室内负压BSL-3•对于危险的或外来的微生物，它们是危及生命的很高个体危险，通过气溶胶或未知传播风险的微生物进行传播，而且目前尚无疫苗或治疗。•这一防护级别代表的微生物为：天花病毒、埃博拉病毒。•危险性在于呼吸暴露接触到传染性的气溶胶、黏膜，或是暴露的损伤皮肤接触到传染唾沫。BSL-4•安全措施：参照三级生物安全实验室操作，+进入前更换衣服出口处淋浴离开实验室时，全部物品都要清除污染•预期的安全设备：全部操作程序均在III级生物安全柜内进行，或者穿正压供气的的连体防护服（Hazmat套服）并I级和II级生物安全柜。BSL-4•实验室设备要求：三级生物安全实验室要求+独立的建筑或明确划分出的隔离区域专用进排气、真空和清除污染系统安全文件明确规定的其他附加要求•重点防止活性微生物污染环境BSL-4微生物危险度等级与生物安全水平、操作和设备的关系危险度等级生物安全水平实验室类型实验室操作安全设施1基础–一级生物安全水平基础的教学、研究GMT不需要；开放实验台2基础–二级生物安全水平初级卫生服务；诊断、研究GMT+加防护服、生物危害标志开放实验台，此外需生物安全柜用于防护可能生成的气溶胶GMT=微生物学操作技术规范微生物危险度等级与生物安全水平、操作和设备的关系危险度等级生物安全水平实验室类型实验室操作安全设施3防护–三级生物安全水平特殊的诊断、研究在二级生物安全防护水平上增加特殊防护服、进入制度、定向气流生物安全柜和／或其他所有实验室工作所需要的基本设备4最高防护–四级生物安全水平危险病原体在三级生物安全防护水平上增加气锁入口、出口淋浴、污染物品的特殊处理Ⅲ级生物安全柜或Ⅱ级生物安全柜并穿着正压防护服、双开高压灭菌器（穿过墙体）、经过滤的空气242.具有合格的人员和标准检验方法人员要有资质，并经常接受培训采用国家标准方法或公认方法（WHO、EPA等）3.加强实验室质量控制仪器、设备、试剂：定期检定和校准注意记录和核查：如GLP实验室报告规范：数据规范，完整签名盖章三、实验室检验原则4.实验室应有应急措施应对突发事件能力需做多种检验时，微生物优先恰当的样品处理与检验25三、实验室检验原则26第二节卫生检验中的指示微生物指示微生物（indicatormicroorganism）定义：在常规卫生监测中，用以指示检品卫生状况及安全性的（非致病）微生物（或细菌）。设定指示微生物的原因微生物（包括致病和非致病的）种类繁多，不可能一一检测环境中致病微生物往往数量少，检测困难，需要用相对易于检测的微生物来间接反映。27一、指示微生物的选择选择原则数量大、易于检出，方法简单，有代表性。指示微生物的种类：反映微生物综合污染：细菌、霉菌和酵母菌落总数反映微生物污染来源：粪便污染指示菌（大肠菌群、粪大肠菌群等）；空气污染指示菌（溶血性链球菌等）不得检出的致病微生物间接反映致病微生物：如反映肠道病毒的噬菌体等消毒效果指示菌：嗜热脂肪芽孢杆菌（压力蒸汽灭菌）；短小芽孢杆菌（电离辐射灭菌）；枯草杆菌黑色变种芽孢（环氧乙烷灭菌）28二、常用的指示微生物（一）综合污染指标——菌落总数定义：单位量的被检样品(g、ml、cm2、m3)内，所含有的能在某种培养基上经一定条件、一定时间培养后生成的菌落数量。表述：细菌菌落总数、霉菌和酵母菌菌落总数。cfu/g、cfu/ml。(cfu，colonyformingunit)意义：综合判定检样被微生物污染程度。方法：标准平板计数法、表面涂布法29（二）来源污染指标——粪便、空气污染指示菌粪便污染指示菌的选择标准是人及温血动物肠道正常菌群的组成部分，且数量大。在粪便污染的样品中易检出，未被污染的样品中无此菌存在。排出体外后，在外环境存活时间与肠道致病菌大致相似或稍长。在外环境中不繁殖。如作为饮用水的指示菌，对氯、臭氧等抵抗力应不低于肠道致病菌或略强。检验方法简便，易于检出和计数。30常见粪便污染指示菌1.大肠菌群（coliformgroup）概念：指一群需氧的或兼性厌氧的，在35-37℃24h培养能分解乳糖产酸产气的G-无芽孢杆菌。种类：大肠埃希菌属、枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属某些种等。卫生学意义评价检样卫生质量，推断有无肠道致病菌污染。总大肠菌群（totalcoliform）—37℃培养生长的大肠菌群。粪大肠菌群（fecalcoliform）（耐热大肠菌群）—44-45℃能发酵乳糖的大肠菌群。方法：发酵法，滤膜法，纸片法31大肠菌群作为指示菌的一些新问题大肠菌群“受损”对细菌计数的影响大肠埃希菌的致病性大肠菌群中某些细菌可以在外界繁殖大肠菌群的检测范围有限水中大肠菌群200cfu/100ml小肠结肠炎耶尔森菌阳性率6.4%水中大肠菌群200cfu/100ml小肠结肠炎耶尔森菌阳性率8.9%322大肠埃希菌(Escherichaecoli)检出意义最大鉴定方法较复杂药品行业使用较多近年应用较多作为粪便污染指示菌，大肠埃希菌检出意义最大，其次是耐热大肠菌群，总大肠菌群再次333.肠球菌(Enterococcus)（粪链球菌)人及动物肠道正常菌群。在人粪数量仅次于大肠菌群细菌，动物粪便中所占比例高。对恶劣环境抵抗力较强，营养水体繁殖力低于大肠菌群。单独检查不能作为粪便污染的决定性指标，但可提供有价值的补充材料。判断污染来源。方法：耐热大肠菌群与肠球菌之比＞4.1污染来源人耐热大肠菌群与肠球菌之比＜0.7污染来源动物耐热大肠菌群与肠球菌之比4.1～0.7混合来源344产气荚膜梭菌(Costirdia)G+有芽孢，还原亚硫酸盐的厌氧杆菌。外界环境抵抗力较强。不适合作为主要指标，但可提供有价值的补充材料。特别适合水样不能及时送检，或在含有有毒物质（氯）的环境中检测是否有过粪便污染。•产气荚膜梭菌（＋）大肠菌群（＋）新近污染•产气荚膜梭菌（＋）大肠菌群（－）陈旧污染35常见空气污染指示菌：口腔和鼻腔的链球菌（无人居住的房屋空气中没有链球菌，房屋内住人越多，链球菌的含量亦越高）。一般用草绿色链球菌与溶血性链球菌合起来计算。36（三）不得检出的致病菌微生物主要危害主要指示作用沙门菌肠道致病菌口服药、食品不得检出志贺菌菌痢食品不得检出金葡菌局部化脓、食物中毒食品、化妆品、外用药不得检出；游泳池水指标菌铜绿假单胞菌条件致病菌外伤、眼科用药、化妆品不得检出，游泳池水指标菌破伤风梭菌外伤皮肤感染外用药不得检出37（四）间接反映致病微生物存在的指示菌肠道病毒指示微生物的条件：检验方法简单操作安全在被人肠道病毒污染的环境中一定存在，数量等于或大于肠道病毒的数目对于消毒剂和外环境的抵抗力应与肠道病毒一致或稍强。38•肠道病毒的指示微生物指示物优点缺点应用大肠杆菌噬菌体f2与肠道病毒耐受性相似；存在于人粪中；检测较简便粪便中数量少；可能在环境中繁殖；检测结果受大肠杆菌DNA噬菌体影响水中病毒消毒效果评价指标脊髓灰质炎病毒减毒疫苗株Ⅰ操作安全非所有粪便有；检测困难应用于消毒学和水中病毒研究39第三节卫生微生物研究和检测的方法（一）样品的处理（二）损伤菌的复苏（三）选择性增菌与分离（四）定量计数方法（五）分型鉴定的方法（六）其他分子生物学方法40混匀样品（非常重要）液体：电动混匀、手摇混匀、敲打混匀固体：搅碎混匀、研磨混匀、匀浆混匀样品浓缩沉淀法过滤法吸附沉淀法一、样品的处理41环境样品微生物，