3遗传毒性

遗传毒性及其评价教材146页概述遗传和变异的关系遗传使物种保持相对稳定；变异则使物种的进化成为可能突变对人类或其他生物是有利还是有害？自发突变：在自然条件下发生。过程长，频率低，与物种进化有关。诱发突变：化学、物理、生物因素引发，过程短，频率高短期内过高频率的遗传物质改变往往有害基本概念遗传毒理学(genetictoxicology)研究环境因素对机体遗传物质和遗传过程的作用，阐明遗传毒性对机体健康的后果及其作用机制，为防止环境因素对遗传物质的损伤、增加生物的遗传负荷，保护生态平衡和人体的健康提供科学依据的一门毒理学分支学科。发展简史1901年，首次提出突变（Mutation）这一术语和生物的进化是因突变产生的理论1927年，Muller发现X射线引起果蝇性连锁隐性致死性突变1942年，Auerbach和Robson发现芥子气的对果蝇有致突变性1969年，国际环境诱变剂学会（EMS)成立创办MutationResearch杂志20世纪70年代形成一个新的分支学科――遗传毒理学1989年，我国环境诱变剂学会成立同年创办《癌变.畸变.突变》杂志遗传毒理学发展现状全世界登记的化学物已达1000余万种，常用的有8万余种目前已经发现大量的化学物质具有遗传毒性，对化学物遗传毒性（致突变/诱变性等）的检测已成为化学品（农药、食品添加剂、日用品等）毒性检测的常规项目之一随着现代分子生物学实验技术、新的实验方法（细胞培养，基因敲除）的日益进展，以及人类基因组研究的不断深入（毒理基因组学），对化学物遗传毒性的研究进入一个新的历史时期第一节遗传毒性的类型因分类方法不同可分为不同的类型，至今尚无一致的意见。从遗传毒性角度基因突变染色体结构改变染色体数目改变DNA损伤一、基因突变基因突变是指基因在结构上发生了碱基对组成和排列序列的改变。1.碱基对替换(base-pairsubstitution)指DNA分子中一个或几个碱基对被另一个或几个碱基对替换。转换(transition)：嘌呤到嘌呤或嘧啶到嘧啶的变化颠换(transversion)：嘌呤到嘧啶或嘧啶到嘌呤的变化。2.移码突变或移码框突变(frameshiftmutation)指基因内插入、缺失一个或多个碱基所引起的突变。碱基置换Basepairsubstitution基因突变移码突变Frameshiftmutation3.三核苷酸重复一特定的三联核苷酸被扩增，重复数目超过正常数目。如CCG三联体核苷酸重复与脆性X综合征4.大段损伤(largefragmentdamage)亦称DNA重排，指DNA序列上有较长的一段序列的重排分布，包括大段(一个碱基至数千个碱基)的插入、缺失、取代、复制、放大和倒位正常ABCDEFGHIJ插入ABCDEKLMFGHIJ缺失ABCDGHIJ取代ABCKLMGHIJ重复ABCDEFGHIJABCDEFGHIJ内重复ABCDEFDEFGHIJ放大ABCDEFGHIJABCDEFGHIJABCDEFGHIJ倒位ABCGFEDHIJ图7－2DNA重排示意图二、染色体畸变由于染色体或染色单体断裂，造成染色体或染色单体缺失，或引起各种重排，从而出现染色体结构异常三、染色体数目异常整倍体畸变：单倍体（n）三倍体（3n）四倍体(4n)多倍体（n2)非整倍体畸变：单体型:2n-1（某一号染色体缺少1条）缺体：2n-2（某号染色体一对均缺）三体型:2n+1（某一号染色体有3条）四体型:2n+2（某一号染色体有4条）四、DNA损伤DNA损伤(DNAdamage)，是指在遗传毒物作用下，DNA结构和功能发生改变，阻碍了DNA的复制与转录或复制与转录产物发生改变。具体指DNA分子一级结构的任何异常改变，包括脱氧核糖、磷酸和碱基的损伤；DNA分子二级结构、三级结构及其构象的异常改变DNA损伤的常见类型第二节遗传毒性的后果一、体细胞突变的后果二、生殖细胞突变的后果体细胞突变的后果体细胞突变与致癌体细胞突变是细胞癌变的重要基础1.许多肿瘤细胞中可同时观察到癌基因和抑癌基因的突变并存在有缺失、易位、倒位等染色体畸变2.化学物质的诱变作用与其致癌作用存在着较高的相关性3.在DNA损伤修复缺陷的人群，癌症也明显高发（着色性干皮病人皮肤癌高发）多阶段致癌模型引发作用通常被看作是一次突变事件促进阶段是否也涉及遗传毒性改变尚不清楚进展阶段也要发生一种或多种遗传改变体细胞突变的后果体细胞突变与动脉粥样硬化症动脉壁平滑肌细胞中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶正常：两种变异体动脉粥样硬化症：一种变异体型故认为动脉粥样硬化斑块是单克隆来源，出自同一突变细胞，是一种良性平滑肌瘤体细胞突变的后果体细胞突变与动脉粥样硬化症间接证据：人和动物斑块的DNA转染NIH3T3细胞后，将之植入裸鼠可产生肿瘤某些已知致突变物显示致动脉粥样硬化和致癌效应。如：氯乙烯、砷、多环芳烃、吸烟体细胞突变的后果体细胞突变与衰老细胞在传代过程中，细胞遗传学异常率逐渐增高，而有丝分裂率逐渐下降。不少突变改变随年龄增长而积累，呈线形或指数曲线上升同时重要的生物功能如遗传信息的转录与翻译速度以及RNA和蛋白质的更新速度也随年龄增长而下降突变的累积可能导致细胞死亡、细胞转化和细胞衰老，从而构成生物体衰老各种表现的基础体细胞突变的后果体细胞突变与致畸(胚胎体细胞)已分化的胚胎细胞：儿童期肿瘤未分化的胚胎细胞：流产或死胎；畸形生殖细胞突变的后果致死性显性致死：突变配子与正常配子结合后，在着床前或着床后的早期胚胎死亡隐性致死：需要纯合子或半合子才能出现死亡效应非致死性显性或隐性遗传性疾病，包括先天性畸形基因库的遗传负荷增加基因库(genepooL)是指一种物种的群体中在生殖细胞内具有、并能传给下一代的全部基因的总和遗传负荷(geneticload)系指一种物种的群体中每一个个体携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。第三节遗传毒性的常用试验方法第一类：检测基因突变第二类：包括染色体结构和/或数目的异常改变第三类：测定ＤＮＡ的损伤一、基因突变检测方法1.鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）：Ames于1975年创建，用于检测受试物诱发大鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株（his-）回复突变成野生型（his+）的能力。正向突变野生型（his+）组氨酸营养缺陷型突变株（his-）回复突变±代谢活化系统受试物Ames试验原理Ames试验标准试验菌株的基因型和检测类型菌株组氨酸突变部位突变类型检测类型TA1537hisC3076C…..C区域+1移码突变TA97hisD6610CCC区域+4移码突变TA98hisD3052CG区域-1移码突变TA1535hisG46AT→GC碱基置换TA100hisG46AT→GC碱基置换部分移码突变TA102hisG428GC→AT碱基置换部分移码突变TA104hisG428GC→AT碱基置换部分移码突变进展目前还不断的发展出新衍生菌株，如YG7104、YG7108，均从TA1535衍生而来由于缺失编码O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基化转移酶的基因而缺乏对烷化剂损伤的修复作用专用于对烷化剂引起的DNA损伤检测。TA7001－TA7006，可鉴定6种碱基对置换突变，每一菌株携带一专一的组氨酸生物合成操纵子的错义突变。这些菌株的自发回变率相当低(约10个回复突变子/皿)，对各种致突变物的敏感性相当于TA100、TA102和TA104菌株。试验在96或384微孔玻板上进行，在培养基中加入pH指示剂。当回复突变的菌株生长时，培养基pH改变，pH指示剂由红变黄，通过分光光度计测定。基因突变试验2.黑腹果蝇伴性隐性致死试验（SLRL）Muller于1927年建立，雄性生殖细胞遗传损伤分析。检测果蝇X染色体上的隐性致死性突变快速、简便，特异度高但敏感性低SLRL试验原理F1XY诱变剂XMYXX+XMXXY+XYF2XMXXXXYXMY不孵化二、染色体结构和/或数目的异常改变1、染色体畸变分析（细胞遗传学试验）制备细胞分裂中期的染色体标本，在光镜下可直接观察到染色体数目和形态的改变。体外培养哺乳动物细胞染色体畸变试验常用CHO、CHL、V79、外周血淋巴细胞啮齿类骨髓细胞染色体畸变试验啮齿类睾丸染色体畸变试验：精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验染色体结构和/或数目的异常改变2.微核试验(micronucleusassay)微核（micronucleus）是染色体的断片或迟滞的染色体在细胞有丝分裂后期，不能进入子代细胞细胞核中，而在间期的子代细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核染色一致，呈圆形或椭圆形。染色体结构和/或数目的异常改变微核来源断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中有丝分裂毒物作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被遗留在细胞质中微核试验检测DNA断裂剂及非整倍体诱变剂啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验胞质阻滞微核试验（CBMN）体细胞培养系统中加入细胞松弛素B，使细胞胞质分裂受阻，但不影响核的分裂，形成双核细胞，仅选择双核细胞进行微核计数，提高微核的灵敏度最常用的是淋巴细胞MN图1-2-2有1个微核的双核淋巴细胞（1000×）图1-2-3有3个微核的双核淋巴细胞（1000×）三、DNA损伤的测试方法1.单细胞凝胶电泳实验(SCGE)也称彗星实验，1978年，RydcbertB创建，1988年，Singh等对操作方法具体描述。原理：各种因素诱发细胞DNA损伤后影响DNA的高级结构，使其超级螺旋松散，经原位裂解、DNA解链等过程后，损伤的DNA断片在电泳时从核中溢出，朝阳极方向移动，产生一个尾状带，未损伤DNA部分保持球形。主要用作DNA链断裂损伤的检测第四节遗传毒性的评价遗传毒性的评价大多均采用组合试验的方法组合原则：①应包含多个遗传终点的原则②包含原核生物与真核生物的原则③包含体内试验与体外试验的原则④包含生殖细胞和体细胞的原则常将试验观察到的现象所反映的事件称为遗传学终点(geneticendpoint)国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点分为五类：①DNA完整性的改变（形成加合物，断裂、交联）；②DNA重排或交换；③DNA碱基序列的改变；④染色体完整性的改变；⑤染色体分离改变。遗传毒理学试验的组合应用表7－5一些国家新药遗传毒性试验的项目试验项目日本欧共体加拿大中国微生物回复突变试验＋＋＋＋哺乳动物培养细胞染色体畸变试验＋＋＋＋啮齿动物微核试验＋＋＋＋体外真核细胞基因突变试验＋－(+)必需做()视情况而定(-)未要求遗传毒理学试验的组合应用国际协调组织（ICH）提出标准组合试验细菌基因突变试验+哺乳动物细胞体外染色体损伤试验或小鼠淋巴瘤细胞tk试验+啮齿动物造血细胞体内染色体损伤试验遗传毒理学试验的组合应用我国农药测试准则提出四项试验组合方案Ames试验小鼠骨髓多染红细胞微核试验哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验遗传毒理学试验的组合应用我国在《食品安全性毒理学评价程序》中对遗传毒理学试验的要求：Ames试验小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验小鼠精子畸形试验睾丸染色体畸变试验备选试验再选择两项试验V79细胞HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，UDS试验遗传毒性评价应注意的问题体外试验的活化系统阳性对照及阴性对照的意义致突变试验与致癌试验的关系对于试验结果的判定重点内容遗传毒性的类型有哪些？遗传毒性的后果（包括体细胞和生殖细胞）