2观察标本的处理

第二讲观察标本的处理切片法：即用刀片将观察标本切成薄片。A.优点：观察标本组织间的各种构造，仍能保持正常的相互关系。B.缺点：在一个切片上就不能看到整个组织外貌。分散法：即用化学的或物理的方法，将观察标本分离成单个细胞或薄片，或者将整个观察标本进行整体封藏。优点—仍能保持每个小单位的完整。缺点—彼此间相互的关系（除整体封藏外）就不一定看得清楚了。第一节整体及局部特征制片第二节扫描电镜观察标本简介第一节整体及局部特征制片一、昆虫整体封片二、昆虫软组织制片技术一、昆虫整体封片（一）昆虫胚卵整体封片（二）昆虫局部器官的整封片（一）昆虫胚卵整体封片1.固定、解剖：将布安氏液(苦味酸、冰醋酸和甲醛以一定比例配制）固定好的卵粒放入蜡盘，注入70%酒精，在实体镜下用尖嘴无齿摄及解剖针撕开卵壳，取出完整的卵胚，放入装有70%酒精的小瓶中。2.染色：用吸管吸去70%酒精，加数滴硼砂洋红浸没标本，染色5-10分钟。3.脱水、透明：用70%酒精洗涤2-3次，再经80%、90%、100%酒精逐级脱水30分钟。然后用二甲苯透明2小时。（一）昆虫胚卵整体封片4.封片：载玻片上滴上粘稠的树脂，把已透明好的胚胎放在树脂内，摆好位置。做好的整封片水平放置在30℃恒温箱中，3一4周后，待树脂充分凝固即可装盒。（二）昆虫局部器官的整封片（气门）1.固定：在实体镜下，取昆虫气门一对，投入70%酒精内固定1小时。2.染色：用吸管吸去固定液，滴入硼砂洋红染色5分钟，吸去染色液后，用70%酒精洗涤几次。3.脱水、透明及封片：经80%、90%、95%酒精逐级脱水15分钟，用100%酒精脱水两次，每次10分钟，用100%酒精和二甲苯等量混合液处理30分钟，转入二甲苯液中透明30分钟至1小时即可用中性树胶封藏。二、昆虫软组织制片技术（一）涂抹制片（二）压碎制片（三）离散制片（一）涂抹制片（血液涂片）1.取血液：用左手持住经乙醚麻醉的虫体，右手持昆虫针刺破幼虫的腹足基部，迅速将伤口流出的血液滴在洗净的载玻片上。2.涂片：左手持血液载玻片，右手持另一个载玻片，以其一端边缘置于血液的左侧。右手将玻片稍向后拉，血液立即充满在两玻片的斜角中，再以30-40度斜角向左均匀推过去，即涂成血液薄膜玻片。3.固定、染色及封片：涂片稍稍晾干，滴甲醇数滴以覆盖血膜，固定3分钟。用吸水纸吸去甲醇液，滴上数滴10%吉姆萨染液，染色10一30分钟或更长。染色后用磷酸缓冲液分色，至着色清晰为度，然后晾干涂片即可封藏。（二）压碎制片-----双翅目幼虫唾液腺的染色体的制片1.取出唾液腺：挑出三龄老熟幼虫放入生理盐水中。左手持尖嘴无齿镊，捏住幼虫尾部约1/3处，右手持解剖针用平稳的力量向右移动，将幼虫的头节拉开可见唾液腺。2.解离：将唾液腺放入盐酸溶液中处理5一8分钟，使腺体细胞分离，然后用吸水纸吸去盐酸溶液。然后用蒸馏水滴洗2-3次。3.染色：用石炭酸品红染液，染色15-20分钟，即可在低倍显微镜下观察核内染色体被染成紫红色，细胞质为浅红色。（二）压碎制片4。染色体释放：将盖玻片压盖于腺体上，随即用解剖针轻轻按压盖玻片，染色体便成串地从破裂处分散到腺体周围。再以拇指对着盖玻片垂直地压一下，既吸去多余的染液，又使染色体的形态及位置固定下来。5.镜检：取出载玻片与盖玻片分别在低倍镜下检查。6.脱水、透明及封片：将载玻片和盖玻片分别经95%、100%和100%三个洒精皿中停留1-2分钟，然后再分别经两个二甲苯皿中透明5分钟，即可用中性树胶封藏。（三）离散制片（肌肉制片）1.解剖蜜蜂，取出肌肉用FAA固定液(甲醇5ml，冰醋酸5ml和70%酒精90ml配合而成)固定24小时。然后经50%、30%酒精和蒸馏水各1-2小时，并多次用蒸馏水洗涤。2.用马克凯郎氏液(硝酸10ml,甘油20ml和蒸馏水20ml配成)浸泡2天。经多次蒸馏水洗涤，将组织块置于载玻片上，盖上盖玻片，轻压并稍转动使组织块分散。3.将分散后的极小组织块加入Orth锂卡红（碳酸锂饱和水溶液100ml和洋红3-5g,煮沸l5分钟,冷却后过滤配成）染色20分钟。然后吸去染液，70%酒精洗涤几次，再用蒸馏水洗涤数次。（三）离散制片4.将组织块放入蒸馏水中，用注射器抽吸冲击使之分散成单个细胞，取上部的悬浮液（内含单一肌纤维）迅速倒入另一瓶中。5.悬浮液自然沉淀后，吸去上清液，经15%、30%、50%、70%、80%、95%、100%各级酒精脱水5-6小时，然后放入冬青油和100%酒精的等量混合液中经24小时，再用纯冬青油透明。6.用吸管吸出单个肌纤维滴入蒸发皿中，加入适量的中性树胶，搅拌均匀后，滴一滴在载玻片，盖上盖玻片封片即成。第二节扫描电镜观察标本简介扫描电镜（SEM）是利用高能微束电子针（电子流）轰击样品表面，使之发出多种信号,再收集其中某种或某些信号加以处理放大而成像的。观察标本制备的一般程序：取样—→清洗—→固定—→洗净—→脱水(逐级进行)—→干燥—→喷镀（导电处理）。现以昆虫表面形态特征的观察标本制备为例说明其制备过程。昆虫表面形态特征标本制备操作步骤：1.取昆虫材料以0.01mol磷酸缓冲液洗净，如被覆有蜡质或粉末，则以二甲苯去除蜡或粉末以求尽量显示其表面形态特征；2.固定，用10%的戊二醛予以固定1小时；3.洗净，以0.1mol磷酸缓冲液漂洗2-3次；4.再将样品放入1%锇酸固定液中固定2小时左右，再洗净，磷酸缓冲浓反复漂洗，洗净锇酸；5.逐次丙酮脱水；6.自然干燥或临界点干燥；7.喷涂，在高真空中以大电流、低电压、加热喷涂金属，使之以原态高速蒸发出来而喷涂于样品表面，形成厚100-200A的金膜，借此导电。8.喷涂后即可观察。