5-氮杂胞苷对小麦生长发育及DNA甲基化的影响

5-azaC处理水稻幼苗对基因组DNA甲基化及水稻生长发育的影响表观遗传学：不需要基因序列改变而产生的可遗传的基因表达改变；主要包括DNA的甲基化修饰和组蛋白氨基酸的末端修饰。表观遗传变异包括:X－染色体失活、转基因沉默、核仁显性和基因组印记等方面。表观遗传变异的原因：是由于表观遗传密码的改变，如DNA甲基化、组蛋白的公家修饰改变等。DNA甲基化：在DNA复制后，经DNA甲基转移酶（DMT）催化，将S-腺苷酰-L-甲硫氨酸(SAM)上的甲基基团连接到DNA分子腺嘌呤碱基或胞嘧啶碱基上，进行DNA修饰的过程。DNA甲基化的方式胞嘧啶甲基化腺嘌呤甲基化DAM(DNA腺嘌呤甲基转移酶)识别回文序列GATC,在此位置两条链的腺嘌呤N-6位置上同时甲基化，同时SAM转变为SAH(S-腺苷高半胱氨酸)在DMT(DNA甲基转移酶）的作用下，CpG（CNG,CCGG）位点胞嘧啶C5被甲基化DNA甲基化作用DNA甲基化的生物学意义影响基因表达状态：通过该表基因调控区DNA甲基化程度调控基因转录参与基因组防御：通过高度甲基化而使外源DNA（如转座子）处于沉默状态提高环境适应能力：在不改变基因型的情况下产生可遗传的新表型DNA胞嘧啶甲基化的种类和形成从化头甲基化(denovomethylation)DNMT3a，DNMT3b在完全没有甲基化的DNA上加上甲基。维持化甲基化(maintenancemethylation)Met1，DNMT1较特异地识别半甲基化状态的DNA，负责在细胞分裂过程中依据DNA母链的甲基化状态给新合成的DNA链上加上甲基。DNA胞嘧啶甲基化检测方法使用对胞嘧啶5’-甲基化状态敏感的限制性内切酶进行酶切处理，然后检测多态性：甲基化敏感扩增多态性(MSAP,MethylationSensitiveAmplificationPolymorphism)胞嘧啶转化为其它碱基，然后对比测序：重亚硫酸盐测序(Bisulfitesequencing)GCmTACT重亚硫酸钠GCmTATT测序此外，还有单核苷酸法，甲基化接受力的检测法，CpG岛分离法和基因活性测量法，基因芯片法等表1甲基化敏感酶对不同甲基化状态DNA的切割结果CCmGG不切割CCmGG不切割CCGGMspI不切割CCGGHpaIICmCGGCCGG原始序列内切酶?MSAP流程：提取基因组DNA（注意发育时期和成长状态相同）………ATCCGGTGGCTTGCCmGGAC……………TAGGCCACCGAACGGCCTG……MspI酶切+接头HapII酶切+接头ATCCGGTGGCTTGCCmGGACATCCGGTGGCTTGCCmGGACTAGGCCACCGAACGGCCTGTAGGCCACCGAACGGCCTGPCRPCRPAGE电泳PAGE电泳MspI5’…CC(m)GG…3’3’…GGC(m)C…5’HpaII5’…CCGG…3’3’…GGCC…3’?重亚硫酸盐测序实验目的使用不同浓度的5-azaC溶液，处理生长早期的水稻幼苗，使其基因组DNA胞嘧啶甲基化水平发生显著的可遗传改变，使用MSAP方法检测DNA胞嘧啶甲基化水平的改变；水稻幼苗因DNA甲基化水平改变而影响基因表达水平，产生明显的表观遗传表型。实验材料1、水稻：日本晴(Oryzasativavarjaponica,nipponbare)2、所需仪器离心机、PCR仪、气浴摇床、水浴摇床、植物生长箱电泳仪、电泳槽、微量移液器、紫外分析仪、分析天平3、试剂（1）植物基因组DNA改良CTAB提取液：bufferA:0.35mol/LSorbitol，0.1mol/LTris-HClpH7.5，0.5mmol/LEDTA;bufferB:0.2mol/LTris-HClpH7.5，0.05mol/LEDTA，2mol/LNaCl，2%CTAB;bufferC:5%N-lauroylsarcosine（2）PCR试剂：TakararTaq，10XPCRbuffer，ddH2O，①预扩增引物：H/M+0:(5´-GACTGCGTACCAATTCA-3´)PCR引物EcoRI+0:(5´-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3´)②选择性扩增引物：H/M+AN:5´-GACTGCGTACCAATTCAA(T,C,G)-3´EcoRI+AN:5´-ATCATGAGTCCTGCTCGGA(T,C,G)-3´。（3）酶切-连接试剂：EcoRI(NEB)，HapII(NEB)，MspI(NEB)，T4DNAligase，T410xreactionbuffer（4）接头：EcoRIadapter:5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’CATCTGACGCATGGTTAAHapII/MspIadapter:5-‘GATCATGAGTCCTGCT-3’AGTACTCAGGACGAGC（5）PAGE试剂：聚丙烯酰胺，尿素，AgNO3，Na2CO3，溴酚蓝（6）银染固定/终止液(10%冰乙酸)，染色液(2升双蒸水预冷，用时加2克硝酸银，3ml37%甲醛)，显影液(2升双蒸水中溶解60克碳酸钠，冷却至10-12ºC，用时，加入3ml37%甲醛，400ul硫代硫酸钠（10mg/ml）)。（7）其它试剂：5-azaC(100mg/mL)，蒸馏水，PVP(20%)，氯仿:异戊醇(24:1)，异丙醇，70%乙醇，RNA酶A(DNase-free)，TE，TAE，琼脂糖，EB，未酶切的λDNA，1xTBE(0.089MTris-borate,0.089MBoricAcid,0.002MEDTA)，3xloadingbuffer(300mMNaOH,97%formamide,0.2%bromophenolblue)。实验方法1、水稻的培养（26℃，暗培养）取水稻水稻种子20粒X7组，将水稻种子用75%的酒精消毒后用无菌水浸泡数小时，当水稻种子露嘴时，分别置于90mm培养皿内的双层滤纸上，加15mL蒸馏水浸种24h（第一天）。2、5-azaC处理水稻幼苗：（1）6组种子分为6个实验组和1个对照组，实验组分别用20mg/mL，40mg/mL,60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL、120mg/mL5-azaC溶液处理，对照组用蒸馏水培养，共处理10天，每2天换处理液1次（第二~十一天）。（2）10天后每个处理随机取10株幼苗嫩叶混合提取DNA，其余麦苗移载大田并观察田间生长情况。2、植物基因组DNA的提取与纯化改良CTAB法(KidwellandOsborn,1992)[8]（1）取不同处理的叶1g，将其在液氮中研磨成粉后转入50ml离心管。（2）向离心管中加入等体积DNA提取缓冲液(A:B:C=1:1:0.4混合，加1%PVP于B液)。（3）置于65℃恒温水浴下摇床，40-50rpm振摇90分钟。（4）加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒10-15分钟后，4℃3000rpm离心10-15分钟。（5）取上层水相加入2/3体积的预冷异丙醇，上下颠倒5分钟并置4℃冰箱内10min。（6）待DNA沉淀后于4℃3000rpm离心收集DNA于管底。（7）DNA于70%乙醇中过夜。（8）取DNA沉淀并风干（第十二天）。（9）在2ml离心管中加1mlTE溶解沉淀。（10）待DNA完全溶解后，加入5ul不含DNA酶的RNA酶，37℃保温30分钟以除去DNA中的RNA。（11）加入等量氯仿:异戊醇(24:1)纯化DNA，轻轻上下颠倒10-15分钟后，4℃3000rpm离心10-15分钟。（12）取DNA沉淀，用70%乙醇过夜洗涤DNA，并将其溶于DNA于200-500ulTE中。（13）取基因组DNA溶液，0.8%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA的质量并据已知的DNAMarker（未酶切的λDNA）估计其浓度；调整DNA浓度，置于-20℃备用。3、水稻基因组DNA酶切（1）甲基化分析采用两种甲基化敏感酶HapⅡ和MspⅠ（NEB）。在限制性酶切和连接前，先把两个单链的接头复性为双链结构(序列见试剂部分)，即100℃变性5分钟，缓慢冷却至室温，-20℃冷冻保存备用。（2）水稻MSAP限制性酶切和连接体系如下：表2水稻MSAP限制性酶切、连接体系T410xbuffer2.5ulBSA(10mg/L)0.1ulEcoRIadaptor(5pM)0.5ulH/Madaptor(50pM)0.5ulEcoRI(20U/ul)0.5ulH/MMspI(10U/ul)0.5ulHpaII(20U/ul)0.25ulT4ligase0.1ulGenomicDNA300ng20ulAFLP-Water补足总反应体积（3）混匀体系，37℃，6小时，8℃，4小时，4℃保存。（4）共四个处理组，即水稻25mg/mL处理组，水稻50mg/mL处理组，水稻100mg/mL处理组，水稻对照组；每组分别用HapII/MspI双酶切，共需切8管（第十五天）。4、预扩增（1）预扩增：水稻AFLP预扩增体系如右表(预扩增引物PCR引物部分)：混匀体系，按下列参数进行PCR扩增反应：表3AFLP预扩PCR体系10xPCRreactionbuffer2.5uldNTPs(2.5mM)2ulEcoRIprimer(5uM)1ulH/Mprimer(5uM)1ulTaqDNApolymerase(5U/uL)0.2ulPCRwater16.3ulDNA模板（预扩增稀释产物）2ulTotalvolume25ul（2）PCR程序：94℃预变性2min,94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸60秒,共进行30个循环，最后72℃延伸10分钟（第十七天）。（3）根据检测结果，用0.1xTEbuffer稀释预扩增产物1/10~1/40，作为PCR选择性扩增的DNA模板。按以下参数进行PCR扩增反应：表4水稻AFLP选择性扩增体系10xPCRreactionbuffer1.5uldNTPs(2.5mM)0.6ulEcoRIprimer(5uM)0.6ulH/Mprimer(5uM)0.6ulTaqDNApolymerase(5U/uL)0.12ulPCRwater9.58ulDNA模板（预扩增稀释产物）22ulTotalvolume15ul94℃预变性2分钟,94℃变性30秒，65℃复性30秒，72℃延伸80秒，以后每轮循环温度递减1℃，扩增10轮。接着94℃变性30秒，55℃复性30秒，72℃延伸80秒，共进行40个循环，最后72℃延伸10分钟（第十七天）。5、PAGE电泳（1）自来水清洗电泳槽，95％酒精擦两遍。（2）硅化：均匀擦涂亲和硅化试剂于大板的一面，剥离硅化试剂于小板的一面5分钟后，95％酒精再擦两遍。（3）装板（4）灌胶【尿素-PAGE胶配制】①灌胶前，加入四甲基乙二胺（TEMED）30ul，10%过硫酸铵（APS）160ul，混匀，立即灌胶。灌胶时玻璃板倾斜15度。②胶聚合1小时以上才可以电泳。表5PAGE胶配方尿素(分析纯）16.8g10xTBE4ml40%丙烯酰胺胶贮液(Acrylamide/Bis19:1)16ml超纯水加到总体积40ml（5）电泳：电泳装置电泳缓冲液为1xTBE，85W预电泳1小时，胶板的温度达到55˚C。点样前，DNA样品95˚C变性5分钟，立即冰浴，加3xloadingbuffer,混匀，瞬时离心，点样量16ul，恒功率55W电泳到指定位置，即可卸板染色。6、银染操作（1）电泳结束后，轻轻分离两块玻璃板，将附着胶的大板置于固定/终止液中，轻摇20分钟，直至指示染料消失。（2）凝胶洗涤，回收固定/终止液，用双蒸水洗涤凝胶3次，每次至少2分钟，凝胶板从水中取出后，竖起空水15秒。（3）染色，将胶板移至染色液中，轻摇30分钟。（4）凝胶显影，将染色后的胶板放入双蒸水中5-10秒，迅速取出并竖起控水，随后把胶板放入预冷的一半显影液中，充分摇动，当出现第一批条带后，倒入另一半显影液，轻摇至条带全部出现。（注意：从放入水中到放入显影液中，时间不应超过10秒。