生物化学

生物分离工程细胞分离与破碎总体学习目的和要求通过本章学习，要求掌握细胞分离和目标产物的释放的原理和方法，熟知各种方法的优缺点和应用范围。目录重力沉降离心沉降细胞破碎与胞内物释放细胞分离－学习要点识记：重力沉降、离心沉降和过滤的概念。理解：重力沉降、离心分离与过滤原理、理论；掌握Stokes沉降公式。应用：常用离心方法及优缺点；利用掌握的提高分离效率的方法分析解决实际问题。细胞分离－重力沉降定义重力沉降是传统化工过程中常用的从含有固体颗粒的流体中将颗粒分离出来的操作。重力沉降是利用流体与颗粒间的密度差，在重力的作用下使颗粒与流体之间产生相对运动，从而实现两者的分离。在生物分离过程中，定义中颗粒为细胞、细胞碎片等有形物千姿百态的微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture细胞分离－重力沉降理论理论假设细胞或细胞碎片按照球形颗粒处理；颗粒在无限稀释的溶液中进行沉降，颗粒之间无相互干扰受力分析球形颗粒重力fg液体的浮力fb颗粒运动方向相反的阻力fs细胞分离－重力沉降理论gdfspg361gdfLpb3614222pgLSdvf重力：浮力：阻力：细胞分离－重力沉降理论当球形颗粒自身的重力与其所受到浮力和阻力达到平衡时，bSgfffgdvpLLSg342则细胞分离－重力沉降理论1Re103当球形颗粒处于滞流区（）时Re24gdvLLSpg182Stokes公式当球形颗粒处于过渡区（）时310Re15.0Re105.06.0Re27.0LLSpggdvAllen公式当球形颗粒处于湍流区（）时53102Re1044.05.074.1LLSpggdvNewton公式千姿百态的微生物世界BacterialmorphologydiagramHigh-densitycellculture球形颗粒？无限稀释溶液？细胞分离－重力沉降理论模型校正形态校正：颗粒的形状系数速度校正：空隙率函数提高重力沉降的途径加入中性盐：双电层排斥电位降低加入高分子絮凝剂：架桥作用形成大絮凝团引入外力PSAA)(F细胞分离－重力沉降理论模型校正形态校正速度校正提高重力沉降的途径加入中性盐；加入高分子絮凝剂引入外力细胞分离－离心沉降定义离心沉降是利用沉降设备使流体和颗粒旋转，在离心力的作用下，由于颗粒和流体间存在密度差，所以颗粒沿径向与流体产生相对运动，从而使颗粒和流体分离。细胞分离－离心沉降理论rdvLLSPS2218)(离心沉降速度令：LLSPdS18)(2rSvS2gdvLLSpg182在说明离心条件时，低速离心常以n表示，而较高速离心，特别是超速离心常用相对离心力（RCF）来表示，是指颗粒离心力与地心引力（重力）之比grngrnmgmamgFRCF252210119.198036004在实际工作中，离心力的数据是指其平均值，即是指在离心aq中点处颗粒所受的离心力。细胞分离－离心分离方法差速离心分级区带离心差速区带离心平衡区带离心差速离心分离差速离心是以菌体细胞的收集或除去为目的的固液离心分离方法，应用某一特定颗粒沉淀的离心力在预定的离心时间内得到一部分颗粒沉淀及包含未沉淀颗粒的上清液。差速离心分离应用实例600g10min15000g10min100000g60min300000g120minnucleiMitochondrialysosomesPlasmamembraneRiosomalsubunitshomogenateFilteredhomogenateSolublepartofcytoplasmSedimentation区带离心分离－前提在离心管内的溶液存在密度梯度。采用事先配好的不同浓度（密度）的梯度介质（蔗糖等），按照浓度从大到小的原则，依次层层加入。加入离心管中的梯度介质经高速离心或静置后可形成连续的密度梯度。操作过程区带离心种类差速区带离心(速度区带离心）平衡区带离心（等密度离心）差速区带离心差速区带离心基于颗粒的大小、形状的分离梯度液的最大密度不能超过所分离颗粒的最大密度动态离心分离方法差速区带离心平衡区带离心梯度液密度范围含盖全部待分离颗粒密度离心过程中，颗粒不断沉降至其浮力密度与梯度液密度相等平衡离心分离方法梯度液的种类和应用细胞分离－区带离心异同区带离心种类差速区带离心平衡区带离心共同点事先在离心管内用低分子量溶质调配好密度梯度梯度介质常用蔗糖常用氯化铯密度梯度最大的密度梯度低于最大密度的沉降样品最大的密度梯度大于最大密度的沉降样品区带形成条件根据各个组分沉降系数的差别，形成各自的区带根据各组分密度差形成区带离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度细胞分离－离心设备分类分类方法名称处理量实验室用离心机，工业用离心机温度常温离心机、冷冻离心机转速低速离心机、高速离心机、超速离心机转子结构管式、碟式细胞分离－常用离心设备Solids-ejectingdiskbowlcentrifugeofpilotsizeforsterilizablecontainedinstallationNozzlemachinewithpressurizedsolidsdischargeforyeastandbacteriaseparation细胞分离－常用离心设备DecantercentrifugeMultichamberbowl,verticalcut细胞分离－管式离心设备AdisposablecellseparationinsertPowerfugeTMone-chamberwithscraper细胞分离－碟片离心设备(a)Solids-retainingdiskbowl,(b)Radialsolids-ejectingdiskbowl,topfeed.(c)Radialsolids-ejectingdiskbowl,hermeticfeed.(d)Axialsolids-ejectingdiskbowl.(e)Nozzlebowlwithpressurizedsolidsdischarge.(f)Nozzlebowlwithperipheraldischargenozzles.细胞分离－离心设备比较管式离心机优点结构简单，转速和离心力较大缺点沉降面积小、处理能力低；碟式离心机优点转子中存在隔板以增大沉降面积，处理能力大缺点结构复杂、转速较低；细胞分离－离心机处理能力粒子在径向上的沉降速度grvdtdrvgs2轴向移动速度2122rrQdtdzuz完全沉降的边界条件0z1rrLz2rr1222122lnrrgrrLvQg细胞分离－离心机处理能力影响因素处理样品的特性，如密度、粒径等溶液的特性，如密度、粘度等离心机机械结构，如r1和r2操作条件，ω细胞分离－过滤定义过滤是利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。过滤本身是一种膜分离技术。在分离细胞、菌体或它们的碎片过程中除了沉降分离方法外，过滤技术也是一种常备的分离方法。细胞分离－过滤过程受力分析推动力：过滤操作以压力差为主要推动力；阻力：过滤过程的阻力来自多孔性过滤介质和介质表面不断堆积形成的滤饼细胞分离－过滤速率cmLRRpAdtdQRm表示介质的阻力；Rc表示滤饼的阻力；μL为滤液的粘度细胞分离－恒压过滤方程Ruth恒压过滤方程020ttKQQ其中，K为Ruth恒压过滤系数，表示为SLLSccpAK122细胞分离－提高过滤速度的途径采用絮凝或凝聚的方法预处理改变料液的性质，降低滤饼阻力加入助滤剂以改变滤饼的压缩性指数，提高过滤速度胞内产物释放－学习要点理解：各种细胞破碎方法原理、优缺点及其适用范围。应用：采用不同的细胞破碎方法对不同细胞进行不同程度的破碎。胞内产物释放－细胞结构（真核细胞与原核细胞）动物细胞没有细胞壁，只有由脂质和蛋白质组成的细胞膜植物细胞细胞膜外有一层坚固的细胞壁酵母细胞细胞壁由葡聚糖、甘露聚糖和蛋白质构成，更加难以破碎真核细胞原核细胞革兰氏阳性菌细胞壁由肽聚糖层组成，壁厚约15～50nm，肽聚糖含量为40~90%，细胞壁较革兰氏阴性菌坚固。革兰氏阴性菌细胞壁在肽聚糖的外侧还有分别由（1）脂蛋白和（2）磷脂和脂多糖构成的两层外壁层，外壁层厚度约8～10nm。胞内产物释放－细胞膜组成（A）（B）胞内产物释放－影响产物释放的环境因素在复杂培养基中生长的大肠杆菌细胞其破碎较单一培养基中生长的大肠杆菌细胞更难；对数生长期的细胞会表现得更加脆弱。从连续培养过程中获得的、具有较高比生长速率的念珠菌的细胞壁更加脆弱，而摇瓶培养的念珠菌体则有更加充裕的机会构建更加坚固的细胞壁。酵母细胞壁的厚度和破碎阻力随年龄增长而增加经常在幼酵母细胞中出现的芽痕（Budscars）可引起酵母细胞局部细胞壁强度的降低胞内产物释放－细胞破碎原理细胞破碎机械破碎高压均浆法，珠磨法、撞击破碎、超声波破碎非机械破碎物理法渗透压冲击、冻结-融化、（超声波）化学法酸碱处理、化学试剂处理生物法酶溶、自溶、噬菌体胞内产物释放－机械破碎之高压匀浆细胞悬浮液在高压的作用下从阀座与阀杆之间的环隙高速（可达到450m/s）喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。胞内产物释放－机械破碎之珠磨珠磨机的破碎室内填充有80～85％（v/v）的玻璃（密度为2.5g/ml）或氧化锆（密度为6.0g/ml）的微球（粒径约0.1~1.0mm）。在搅拌桨的高速搅拌下微球高速运动，微球与微球之间以及微球和细胞之间发生冲击和研磨，使悬浮液中的细胞受到研磨剪切和撞击而破碎。胞内产物释放－机械破碎之撞击破碎撞击破碎原理：细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为数千℃/min），形成粒径小于50微米的微粒子，高速载气（如氮气，流速为300m/s）将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。胞内产物释放－机械破碎之超声波破碎压电传感器将电子振荡器的交变电流转换为声波。在超声波的作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。胞内产物释放－非机械破碎之酸碱处理化学试剂处理酶溶自溶渗透压冲击法冻结-融化法胞内产物释放－破碎方式比较机械破碎非机械破碎物理化学生物速度效率选择性释放率条件高高差大剧烈较低差高低温和低差高低视方法定低差高低胞内产物释放－胞内产物释放模型细胞破碎速度与未破碎细胞浓度x成正比从破碎的细胞释放产物的速率与胞内未释放的产物浓度成正比模型假设：模型推导试根据－=kDx①,=kR(cD－c)②,cD=cM(x0－x)/x0③推导细胞内产物两步释放过程的速率方程：+(kD+kR)=kDkR(cM－c)x:未破碎的细胞浓度；x0:初始细胞浓度；c,cD：分别为胞外和破碎的胞内产物浓度；cM：产物的最大释放浓度；kD,kR：分别为细胞破碎和产物释放速率常数。22dtcddtdcdtdxdtdc•证明：由②得，＝kR（－）,将③代入之，•=kR（－·－）=kR·kDx－kR••+(kD+kR)=kRkDx+kD=kDkR·x+••kDkR(cD－c)=kDkR(cM－c)（将③代入之）22dtcd0xcM22dtcd22dtcddtdcDdtdcdtdcdtdcdtdc0xcM0xcM0xcMdtdcdtdx如果破碎或释放其中一步很快，则成为表观一级释放过程，速率方程分别为：破碎速率控制的速率过程(kDkR)：dc/dt=kD(cM-c)释放速率控制的速率过程(kRkD)：dc/dt=kR(cM-c)*凝聚coa