7仪器分析-色谱

第一节概述Introduction色谱法是一种物理化学分离方法,利用不同物质在两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数（或吸收系数，渗透性等）,当两相做相对运动时，这种物质在两相中反复多次分配,从而使各物质得到完全的分离。之后，通过检测器得以检测，进行定性定量分析。第七章色谱分析法Chromatography1906Tswett研究植物色素分离，提出色谱法的概念；1941Martin和Synge提出液-液色谱理论；1952James和Martin发展了气相色谱；1956VanDeemter提出速率理论；1967Kirkland等研制高效液相色谱法；80年代以后出现毛细管电泳和毛细管电动色谱等一系列新的色谱分析方法。一、历史分离对象--植物色素色谱柱---玻璃管固定相---碳酸钙流动相---石油醚ts二、分类按流动相分气相色谱（GC）液相色谱（LC）超临界流体色谱（SFC）按机理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱排阻色谱纸色谱薄层色谱按固定相在支持体中的形状分柱色谱平板色谱按分离效率分经典液相色谱高效液相色谱二、分类最新进展微柱色谱毛细管电动色谱三、基本概念与术语(掌握)1、色谱流出曲线（chromatogram）(色谱图)指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。色谱流出曲线示意图WbW1/21/2h0.607h2色谱流出曲线根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；根据色谱峰的保留值及其区域宽度，可以评价色谱柱分离效能；根据色谱峰两峰间的距离，可以评价固定相（或流动相）选择是否合适。2、常用术语（1）基线无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。(2)峰高(3)峰宽峰底宽Wb峰半宽W1/2标准偏差色谱参数示意图1/2h0.607hW1/22WbtRt0（4）保留值保留时间tR——进样到出现色谱峰的时间保留体积VR——进样到出现色谱峰时消耗的流动相体积死时间t0——流动相流过色谱柱的时间死体积V0——色谱柱的空隙体积F——流动相流动线速度(5)相对保留值r代表峰分开的程度，其不等于1是色谱分离的前提。r=1不能分开（5）分配系数和分配比（容量因子）分配系数K：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相浓度的比值分配比（容量因子）：一定温度与压力下两相达平衡后，组分在固定相和流动相量的比值固定相重量流动相重量分配系数K（热力学性质）K只与固定相和被分离物质的性质有关K值的差别是分离的先决条件，差别越大，分离的可能性越大K值大的组分后出峰K与k的关系：（6）分配比(容量因子)k与保留值的关系色谱基本保留方程证明：当组分一半流出色谱柱时mRCVSSmCVCV0色谱基本保留方程四、分离效能指标1、选择性（相对保留值r）(重复ppt13)相对保留值由两组分的热力学性质决定，与色谱柱的长短粗细无关。2、峰宽度3、分离度(分辨率,色谱峰分离度)分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：R1.0两峰有部分重叠R=1.0两峰达98%分离，两峰基本分离R1.5两峰达99.7%分离，完全分离的标准）《中国药典》规定R应大于1.5，用R=1.5作为相邻两组分已完全分离的标志小结色谱法研究的核心：选择最适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。第二节色谱理论一、塔板理论目的——从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过这一方程各参数来研究影响分离的因素。塔板理论的四个假设1、在柱内一小段长度H内，组分可以在两相间迅速达到平衡。这一小段柱长称为理论塔板高度H。2、流动相（如载气）进入色谱柱不是连续进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积（ΔVm）。3、所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试样沿轴（纵）向扩散可忽略。4、分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某一塔板上的量无关。r——塔板数N——转移次数设：有A、B两组分，kA=2kB=1/2当N=0r=0A组分在两相分配达平衡后：流动相分量=固定相分量=r0r1r2。。。。。。。。rn下表列出经过各级转移后组分在每一级塔板中的量：r0r1r2。。。。。。。。rn当经过1次转移（N=1）以后：第0级塔板：r=0组分的分量=第1级塔板：r=1组分的分量=组分在两级塔板上的量可表示为：若抽象成一个规律：由上表可以看出，经N次转移后，组分在各级塔板上的量符合二相式分布，即当N=4时，组分分布在5级塔板上：以A组分为例，5级塔板上的分量分别是：Nqp)''(任一级塔板上的分量为的展开式对应的一项，可用一个通式表示：当求最后一级塔板的组分的量时，r=n，以作图，即得色谱流出曲线，因此上式称为流出曲线方程。tCtRCmax对于两个组分A和B，如果k不同，则流出曲线的形状不同：由于所获得的流出曲线在N很大时呈正态分布，因此可将流出曲线方程转化为正态分布方程形式：将此方程与标准正态分布曲线方程比较：可知：所以：或：根据：所以：n称为色谱柱的理论塔板数。因为tR是热力学常数，当色谱柱的长度一定，理论板数目n越大，色谱峰越窄。neff与n的关系：1、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔板数为n的色谱柱上分离的情况；小结2、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；3、既然色谱分离的依据是组分在两相中的分配能力差异，因此，两相不限于液-固相，对气体成分而言，亦可是气-固项或气-液相。问题怎样提高色谱柱的理论塔板数n，从而提高色谱柱的效率？二、速率理论1、塔板理论的不足塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。2、VanDeemter方程1956年VanDeemter提出速率方程，指出了提高柱效率的途径：VanDeemter方程式中u——流动相流动的线速度（1）A——涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散——为填充的不规则因子dp——固定相颗粒粒径涡流扩散示意图结论：细而均匀的颗粒，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。（2）B/u——纵向分子扩散项指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽B=2rDm式中：r——弯曲因子，填充柱r1空心柱r=1Dm——组分在流动相中的扩散系数由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。（3）Cu——传质阻力项指组分在流动相和固定相之间传质的阻力固定相传质阻力流动相传质阻力q和为与两相的构型和性质有关的常数dp和df为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度综上所述，速率方程为：问题：1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？2、空心柱是否能够用于色谱分离？3、如何获得色谱最佳流速？高效液相色谱HPLC和超高效液相色谱UPLC3、影响谱带展宽的其它因素柱前展宽、柱后展宽、柱外效应进样器死体积大、进样量大，进样速度慢柱前后连接管道死体积大检测器死体积大使用内径更小的柱子。GC/MS要用o.25mm以下的柱子。减小固定相百分组成或固定相液膜厚度。减小进样量。选用更长的柱子。使用程序升温改善后流出组分峰形。@好的进样技术可以保障高柱效。进样应该紧凑快速，以免峰展宽。如何提高柱效三、分离条件的选择1.色谱分离的基本方程综合塔板理论和速率理论，可获得影响色谱分离效率的因素：nkkrrR11411,21,2提高分离度的途径1、n2、增大容量因子k：R随k增大而增大，但是分析时间也随之延长为了增大k值，可采用的方法：（1）GC:增加固定液的用量，适当降低柱温（2）LC:适当采用极性较小一些的流动相3、增大选择性因子r值:由于r的微小变化，都对R有很大的影响，增大r值是改善分离度的最有力的手段为了增大r值，可采用的方法：（1）GC:适当降低柱温（2）LC:通过控制固定相和流动相的性质来调整存在的问题：r的变化不像n和k有规律可循nkkrrR11411,21,2u在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：2.载气及流速的选择uHminuopt由图可见存在最佳流速（uopt）。实际流速通常稍大于最佳流速，以缩短分析时间。HC传质阻力项A涡流项分子扩散项m(optm)}}B{H=A++CmBm柱效受载气线速度和流量影响。曲线的最低点代表最小板高HETP(或最大每米理论塔板数)也就是最好的柱效。毛细管柱中不存在“A”项。柱效与载气线速度H与线速度形成的曲线叫做VanDeemter曲线。曲线最低点的线速度值即为可获得最好柱效的最佳线速度值。3.柱温的选择3.柱温的选择(p226-227)选择柱温要兼顾几方面的因素。一般原则是：在使最难分离的组分有尽可能好的分离前提下，采取适当低的柱温，但以保留时间适宜，峰形不拖尾为度。具体操作条件的选择应根据实际情况而定。另外，柱温的选择还应考虑固定液的使用温度，柱温不能高于固定液的最高使用温度，否则固定液挥发流失，对分离不利。控制在固定液的最高使用温度（超过该温度固定液易流失）和最低使用温度范围之内。3.柱温的选择(p226-227)对于宽沸程的多组分混合物，可采用程序升温法，即在分析过程中按一定速度提高柱温，在程序开始时，柱温较低，低沸点的组分得到分离，中等沸点的组分移动很慢，高沸点的组分还停留于柱口附近；随着温度上升，组分由低沸点到高沸点依次分离出来。恒温程序升温在整个分析过程中，色谱炉温保持恒定。用初始时间设定运行结束时间。升温速率设为“0”。后流出的峰展宽。当组分有较宽的沸点范围(100°C)时使用。减少分析时间并使峰变窄。增加柱流失，引起基线漂移。可设多阶程序升温。HP6890可设“快速变化速率”至120°C/min。柱温操作第三节气相色谱仪一、气相色谱仪载气净化器流量计色谱柱柱箱汽化室检测器记录器进样放空气相色谱仪流程图PurposeOfThisCourseTolearntheoperationsofthe6890G.C.whileachievingabasicunderstandingofthefunctionandimpacteachofoftheG.C.componentshasonsampleanalysisandtolearnbeginningtroubleshootingskills.色谱柱流量控制器稳压器空气氢气载气分子筛脱水管固定进样口检测器电子部件PC限流器典型的气相色谱须使用GC专用铜管或不锈钢管。塑料管会渗透O2和其它污染物。还可能会释放其它可被检测到的干扰物。管子使用前先用溶剂冲洗，载气吹干。根据工厂的推荐，每用完3瓶气，应更换过滤器，以防止发生气体的污染。每隔一定时间，应对所有外加接头进检漏（大约每隔4-6个月。管路和净化器5975MSD和6890GC气相色谱仪主要包括四部分：1、载气系统2、进样系统3、分离系统4、检测系统1、载气系统载气由压缩气体钢瓶供给，经减压阀、稳压阀控制压强和流速，由压强计指示气体压强，然后进入检测器热导池的参考臂，继而进入色谱柱。最后通过热导池、流量计而放入大气。气相色谱对载气的基本要求：（1）纯净通过活性炭或分子筛净化器，除去载气中的水分、氧等有害杂质。（2）稳定采用稳压阀或双气路方式：载气质量数的峰宽平滑对称的峰合适的电子倍增器电压适当的丰度值低水峰及空气峰正确的质量分配合适的相对丰度合适的同位素比例标准谱图调谐报告（3）常用的载气：氮气氢气氦气2、进样系统包括进样装置和汽化室。进样通常用微量注射器和进样阀将样品引入。液体样品引入后需要瞬间汽化。汽化在汽化室进行。对汽化室的要求是：（1）体积小；（2）热容量大；（3）对样品无催化作用载气入口接色谱柱散热片加热块汽化室示意图对高分子样品，采用裂解装置：管式炉裂解器热丝裂解器居里点裂解器载气入口尼龙6/66共聚物在6500C的裂解色谱图3、分离系统色谱柱填充柱毛细管柱固定相固体固