实验一细菌的形态结构

实验室规则•接触到病原菌，一定要坚持无菌操作•进实验室穿上白大衣，离开时反折•严禁饮食，也不要以手抚摸头、面等部位•若发生吸入菌液，割破手指等事故，必须报告老师•接触过菌液的吸管、玻片等器材，投入含有2~3%来苏儿的容器内•实验完毕，整理桌面微生物实验要求•做实验后要认真完成实验报告，所得结果必须真实记录浙江大学实验报告•课程名称：实验类型：•实验项目名称：•学生姓名：专业：学号：•同组学生姓名：指导老师：•实验地点：实验日期：年月日•实验目的和要求（必填）•实验内容和原理（必填）•主要仪器设备•操作方法与实验步骤•实验数据记录和处理•实验结果与分析（必填）•讨论、心得实验一革兰氏染色、细菌接种实验内容一，革兰氏染色（操作）二，细菌接种•平板划线法（操作）•斜面培养基接种法（操作）•半固体培养基接种法/穿刺接种法（操作）•液体培养基接种法（操作）•细菌在液体、固体、半固体培养基中的生长现象（示教）显微镜的使用和保护---原理•油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质称为油浸系。这种油常选用香柏油•如果玻片与物镜之间的介质为空气，称为干燥系，当光线通过载玻片后，受折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这就降低了视野的照明度•香柏油的折射率n＝1.515，与玻璃n＝1.52相近。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射油浸没物镜介质：空气；香柏油油镜的识别•油镜的镜筒最长，透镜直径最小，上面刻有90倍或100倍或Oil等油镜的使用•先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到物像，并将观察部分移至视野的中央。•转动旋转盘，使高倍镜移向一侧，在盖玻片上滴一滴香柏油，然后将油镜对准通光孔，使油镜下端与香柏油接触(注意操作动作要慢，以免压碎玻片或损坏镜头)。•从目镜内观察，微微上下转动细调节器，至视野内出现清晰的物像时为止。•油镜使用完毕后，必须用拭镜纸沾少许二甲苯将油镜上的香柏油擦净，并用干的拭镜纸檫去二甲苯。•显微镜用毕后，升高镜简，取下玻片标本，转动旋转盘，使每个物镜都不对准通光孔，再下降镜筒，使物镜接近载物台，将聚光镜降下，最后放回橱内。革兰染色法•由丹麦C.Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G-）两大类•细菌细胞壁的结构革兰染色法－－原理•G＋菌胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入。同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫—碘复合物从胞内渗出，故细菌仍保留初染时的紫色。•G－菌胞壁结构较为疏松，肽聚糖层很薄，外膜含大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性变大，使结晶紫--碘复合物被乙醇溶解析出而脱色，故细菌呈复染时的红色革兰染色方法•初染：滴加结晶紫染液,染1分钟,水洗.•媒染：滴加卢戈氏碘液,作用1分钟后,水洗.•脱色：加95%酒精2~3滴于涂片上,频频摇晃3~5秒钟后,斜持玻片,使酒精流去;再滴加酒精,如此反复2~3次,直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色时为止,约半分钟。水洗•复染：滴加稀释石炭酸复红染1/2~1分钟,水洗,待干,油镜检查.（紫碘酒红、分分半半）革兰染色结果--阳紫阴红•凡能固定结晶紫与碘的复合物,而不易被酒精脱色,仍保留紫色,称为革兰阳性菌.•凡易能被酒精脱色,再经复染成红色的细菌,称为革兰阴性菌•仔细观察（染色性，形态，排列），绘图革兰染色的意义•鉴别细菌：鉴别G+,G-,初筛标本•选择用药•致病物质–大多G+外毒素，G-内毒素细菌材料玻片标本制备•涂片------干燥------固定•涂片：先取一接种环生理盐水放于载玻片的一端，左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中挑取少许大肠杆菌或葡萄球菌培养物与盐水混匀，涂成直径约1厘米的涂片，涂片应薄而均匀。•干燥：涂片最好放置室温中，待其自然干燥。•固定：手执玻片的一端标本面向上，在火焰外层较快地来回通过三次，约2~3秒，以玻片反面触及皮肤，以不觉过分地烫为度。待放置冷却后，进行染色。•掌握无菌操作–拔或塞试管帽时，应将试管口通过火焰略加烧灼；–接种环使用前后应在火焰上烧灼灭菌固定的目的①杀死微生物，固定其细胞结构②保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉③改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。细菌生长繁殖的条件•充足的营养物质–水，碳源，氮源，无机盐，生长因子•合适的外界环境–温度–酸碱度–气体–渗透压培养基的类型1.按照培养基的成分来分(1)合成培养基。合成培养基的各种成分完全是已知的各种化学物质。这种培养基的化学成分清楚，组成成分精确，重复性强，但价格较贵，而且微生物在这类培养基中生长较慢。如高氏一号合成培养基、察氏（Czapek）培养基等。(2)天然培养基。由天然物质制成，如蒸熟的马铃薯和普通牛肉汤，前者用于培养霉菌，后者用于培养细菌。这类培养基的化学成分很不恒定，也难以确定，但配制方便，营养丰富，所以常被采用。(3)半合成培养基。在天然有机物的基础上适当加入已知成分的无机盐类，或在合成培养基的基础上添加某些天然成分，如培养霉菌用的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。这类培养基能更有效地满足微生物对营养物质的需要。2.按照培养基的物理状态分(1)固体培养基。是在培养基中加入凝固剂，有琼脂、明胶、硅胶等。固体培养基常用于微生物分离、鉴定、计数和菌种保存等方面。(2)液体培养基。液体培养基中不加任何凝固剂。这种培养基的成分均匀，微生物能充分接触和利用培养基中的养料，适于作生理等研究，由于发酵率高，操作方便，也常用于发酵工业。(3)半固体培养基。是在液体培养基中加入少量凝固剂而呈半固体状态。可用于观察细菌的运动、鉴定菌种和测定噬菌体的效价等方面。3.按照培养基用途分：(1)加富培养基。是在培养基中加入血、血清、动植物组织提取液，用以培养要求比较苛刻的某些微生物。(2)选择性培养基。是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。(3)鉴别培养基。是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。一，平板划线法（操作）平板分区划线平板分区划线平板划线法•是一种分离培养法接种培养长出单个菌落实验步骤（平板划线法）•不要说话，严格无菌操作•灼烧接种环后要冷却•取一环葡萄球菌或大肠杆菌•划线时用腕力，不要使接种环嵌入琼脂•各个分区要分明•在培养皿底部贴标签•倒置培养以防止结晶水冲散细菌二，斜面培养基接种法（操作）斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞实验步骤（斜面接种法）1.用左手握住菌种管（葡萄球菌或大肠杆菌）和斜面培养基管，右手持接种环。2.用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌。3.用接种环或接种针伸入菌种管内，挑取用来接种的菌苔。4.伸入斜面培养管内，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上蜿蜒划线。5.接种完成之后，用火焰灭菌培养管口，并塞上棉塞，置于37℃培养。三，半固体培养基接种法/穿刺接种法（操作）穿刺接种法实验步骤（穿刺接种法）1.用左手握住菌种管（大肠杆菌或痢疾杆菌）和半固体培养管，右手持接种针。2.用右手小指与手掌、小指与无名指分别拔出两管的棉塞，将管口通过火焰灭菌几次。3.用接种针伸入菌种管内，挑取用来接种的菌苔。4.垂直刺入半固体中心，至近管底部，然后沿穿刺线退出。5.塞回棉塞，接种针重新灭菌。接种完毕，于37℃培养18—24h，观察生长情况。四，液体培养基接种法（操作）实验步骤（液体培养基接种法）•用灭菌接种环挑取用来接种的菌苔。–菌种管：葡萄球菌/大肠埃希菌/痢疾杆菌•在试管内壁与液面交界处轻轻研磨，使细菌均匀得散落在液体培养基中。五，细菌在液体、固体、半固体培养基中的生长现象（示教）•固体培养基上的菌苔和菌落•半固体培养基示教样本：大肠杆菌痢疾杆菌•液体培养基菌膜菌沉淀均匀浑浊对照显教样本：大肠杆菌枯草杆菌乙型链球菌