神经生物学综述 (原创)湘雅医学院

神经干细胞定向诱导分化研究进展以及其在帕金森病治疗中的临床应用【摘要】神经干细胞有自我复制及多向分化潜能，在遗传物质控制及多种外来信号的调控下体外培养易获得细胞形态结构及功能成熟的多巴胺能神经元，成为近几年来兴起并得到快速发展的干细胞移植治疗帕金森病的理想种子细胞。在对帕金森病的神经干细胞移植治疗中，移植干细胞的数量及定向想向多巴胺能神经元分化的比率是必须解决的问题，因而有效的神经干细胞体外增殖与多巴胺能神经元的大量定向诱导分化是解决问题的关键所在。【1】目前神经干细胞定向诱导还处于实验室阶段，但是笔者相信伴随分子生物学技术的应用和发展，以及对NSCs分化本质的不断认识，NSCs定向分化为DA能神经元的基因调控机制研究将会得到进一步深入。认为在不久的将来，随着这些机制的逐渐被阐明，就可能通过人为地控制NSCs分化的各种因素将其高效、定向诱导分化为DA能神经元，最终达到有效缓解甚至彻底治疗PD的目的。一、对神经干细胞定向分化在帕金森病治疗中作用的发现与肯定神经干细胞通过培养增殖，在细胞内外信号调控诱导下可以定向分化为多巴胺能神经元，产生大量有中枢功能的神经元，可以补充或替代患者受损神经元，减轻因多巴胺神经元损伤带来学习、记忆、精神方面的异常。张力等【2】在人胚神经干细胞及骨髓基质细胞移植治疗帕金森病恒河猴模型的实验研究中发现中脑神经干细胞由于其本身所具有的域特异性生物学特征较其他来源的神经干细胞更易向DA能神经元分化。中脑神经干细胞可能成为移植帕金森病恒河猴模型最合适的移植供体。他们初步肯定了神经干细胞的治疗作用，还认为中脑干细胞为合适移植供体。陈东【3】在实验中发现以机械分离法获得的NSCs在无血清培养基培养后，能够不断增殖且保持NSCs的生物学特性。将其定位移植到PD模型大鼠纹状体内，可明显改善后者的行为。移植细胞能在PD模型大鼠纹状体的存活、迁移，并分化为多巴胺神经元以替代损伤的该种神经元而达到治疗PD的目的。本研究结果为帕金森病等神经退行性疾病的临床治疗提供实验依据。二、可以定向诱导神经干细胞分化的因素的研究进展神经干细胞的分化主要由两个方面进行调控：一是干细胞的遗传基因，二是干细胞所处的外部培养微环境。目前对于干细胞分化的研究除了其自身基因的调控外，多侧重于外来信号的调控。早在2003年，有论文关于PDGF和AⅡ渔新生大鼠海马EGF反应性神经干细胞定向诱导为神经元的影响【4】实验的出结论：体外PDGF促进新生大鼠海马EGF反应性神经干细胞分化并诱导神经元生成，促进神经元存活，ATRA也诱导EGF反应性神经于细胞向神经元分化，作用较PDGF作用弱，两种因子有协同效应。提出诱导神经干细胞定向分化时多种因子同时协同起作用，后来的很多文章及实验也阐明，光依靠如神经营养因子等单独作用，诱导的效果较差，且诱导细胞达预期目的的比例较小，不适合于该项技术的发展与临床应用。田关玲等【5】也通过实验发现中脑来源的NSCs本身具有一定的分化为多巴胺神经元的区域特异性，而皮质来源的NSCs在IL-lα、IL-11“、LIF及GDNF等细胞因子的诱导下可改变其区域特异性而分化为较多较为成熟的多巴胺神经元，并且再一次肯定了大脑不同区域的神经干细胞诱导分化潜能的差异。相关实验关于在体外无血清条件下联合应用bFGF、PDGF、RA、HRG、Forskolin对大鼠神经干细胞向神经元定向诱导分化是可行的，分化的神经元比例高，且细胞更具有神经电生理特性。【6】实验中通过联合用上述诱导因子，部分Nscs向神经元分化，而且诱导出的神经元比例较其它组高，神经元的胞体面积、周长及最长突起长度等指标均优于其它组。因此实验者推测其中可能和RA与其它因子在同一时问点作用于神经干细胞，通过几种因子的协同作用触发基因表达，从而促进神经干细胞向神经元的分化，如Forskolin与RA协同作用可以进一步增加p21的表达，减少周期蛋白的表达，促进细胞的分化¨引，bFGF能增加NscsRAR—amRNA的表达，从而能增强RA诱导NsCs分化的作用。时间上很近地，有学者也做了相似的实验，证明EGF、bFGF、NGF、RA对小鼠神经干细胞（NSCs）增殖及定向分化有诱导作用。【7】星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化【8】实验采用的星形胶质细胞条件培养液中含有多种营养因子，各营养因子的不同作用机制间可能存在互补作用，如脑源性神经营养因子是通过上调后代中转录因子Brn-4介导起作用。但星形胶质细胞条件培养液成分较为丰富，其具体作用机制仍未完全阐明，尚有待深入分析。另外，实验所选取的室管膜前下区神经干细胞其在体内条件下最终分化为多巴胺能神经元和Y一氨基丁酸能神经元，而在体外条件下星形胶质细胞条件培养液对其分化为Y-氨基丁酸能神经元的作用如何也需进一步分析。近几年，对于神经干细胞定向分化诱导因子的研究探索还是研究的热点，2009年辛志成在他的硕士毕业论文中谈到关于BMP2及ACM对SVZa神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元，实验发现（l）、从孕16天Wistar大鼠SVZa脑组织中成功分离得到具有不断增殖和自我更新能力，并可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。（2）、BMP2可以促进SVZa神经干细胞分化为多巴胺能神经元，但不完全是剂量依赖性的，而是有一个最佳浓度，即10ng／ml的BMP2作用最明显。（3）、ACM可以促进SVZa神经干细胞向多巴胺能神经元分化，而且BMP2与ACM具有正协同作用。【9】在近期发现的Oli92过表达对神经干细胞向少突胶质细胞分化的影响。【10】实验采用RT-PCR，以新生大鼠脊髓RNA为模板，扩增oli92基因，定向克隆到pEGFP-N3载体中。用电穿孔方法转染pEGFPN3-oli92表达载体至NSCs中。用RT-PCR鉴定oli92的表达，用免疫荧光显色鉴定NSCs向少突胶质细胞的分化情况。结果：成功构建了pEGFP-N3-oli92真核表达载体；oli92在重组质粒转染的NSCs中能够高效表达；重组质粒转染的NSCs在体外诱导分化后，能够较空质粒转染的NSCs产生更多的受体相互作用蛋白(RIP)阳性细胞。除了作用因子本身性质外，同种诱导因子因作用时间不同、作用浓度不同也可以导致完全不同的诱导效果。王振宇等【11】在表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度的实验研究中发现在20μg/L表皮生长因子培养条件下，脑源性神经生长因子促使神经干细胞向神经元分化的较佳质量浓度为50μg／L。另外潘灏等【12】在肯定了胰岛素对神经干细胞诱导作用后，发现不同浓度的胰岛素的诱导效果有较大差异。100ng／ml的胰岛素具有较好的促进神经干细胞向神经元分化的能力，为进一步实验奠定了基础。但是目前对于胰岛素促进神经干细胞增殖和促其向神经元分化的机制还不甚明了，有待于进一步的实验研究。有文章提到脑源性神经生长因子促进成年大鼠脑海马神经干细胞定向分化的浓度对神经干细胞诱导定向分化有影响。诱导时间对大鼠中脑神经干细胞体外分化成多巴胺能神经元的能力存在影响，诱导6d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比例最高。【13】三、结论关于定向诱导神经干细胞分化的很多分子机制、实验条件控制、内在遗传物质与外在信号相互作用等很多方面还不是很了解，因此，目前关于神经干细胞定向诱导用于治疗帕金森病还处于实验室阶段。高伟东等【14】给小鼠移植外源性的NSCs（将NSCs经眶后静脉移植到小鼠体内），外源性NSCs可以在脑损伤小鼠脑内存活．并能促进脑损伤小鼠的神经功能恢复。在损伤灶的远隔部位也可以看到较多的NSCs．提示NSCs移植后不仅能够存活．同时可发生一定的迁移，并与宿主细胞较好的整合。但移植后的神经干细胞是否可以定向诱导分化成为了关键问题，目前还没彻底解决。但研究提示我们NSCs移植对于修复受损脑组织是一种有效的治疗方法。1、抗坏血酸定向诱导神经干细胞分化为多巴胺能神经细胞及其机理研究郑敏王冬梅侯玲谢超李海民焦文仓白慈贤王亚平裴雪涛2、人胚神经干细胞及骨髓基质细胞移植治疗帕金森病恒河猴模型的实验研究张力20033、神经干细胞分化的研究进展陈东第四军医大学吉林军医学院（现吉林医药学院）学报2005年6月4、PDGF和AⅡ渔新生大鼠海马EGF反应性神经干细胞定向诱导为神经元的影响佳本斯大学硕士学位论文20035、IL-1仪及与IL-11、LIF和GDNF联合诱导胚鼠皮质、中脑神经干细胞向多巴胺神经元分化的比较田关玲金国华谭雪锋朱惠霞秦建兵黄镇神经解剖学杂志20056、神经干细胞向神经元诱导和分化的研究孙晓莉袁颖张天姜正林林巍巍陆璐王晓冬神经解剖学杂志NoV．200622(6)591～5967、EGF、bFGF、NGF、RA对小鼠神经干细胞定向分化的调控姬西团章翔费舟张剑宁刘卫平蒋晓帆林绿标王西玲曹锐峰潘灏中华神经医学杂志2005年6月第4卷第6期8、星形胶质细胞条件培养液体外诱导胎鼠室管膜前下区神经干细胞向多巴胺能神经元的分化辛志成，周政，严稽文中国组织工程研究与临床康复，2009，13(6)：1040-10449、BMP2及ACM对SVZa神经干细胞诱导分化为多巴胺能神经元作用的实验研究姓名：辛志成申请学位级别：硕士专业：外科学（神经外科）指导教师：周政2009050110、Oli92过表达对神经干细胞向少突胶质细胞分化的影响吕合作、陈治文、胡建国解剖学杂志2010年第33卷第6期11、表皮生长因子培养条件下脑源性神经生长因子诱导大鼠海马神经干细胞向神经元分化的最佳浓度王振宇，佟雷，季丽莉，赵久红，唐源远200812、不同浓度胰岛素对小鼠神经干细胞分化的影响潘灏章翔刘卫平姬西团梁景文立体定向和功能性神经外科杂志2005年第18卷第4期13、诱导时间对体外培养大鼠神经干细胞向多巴胺能神经元分化的影响柯春龙，陈白莉，金华伟，郭少雷中国组织工程研究与l脑床康复，2008，12(34)：678l-678414、胚胎神经干细胞对脑损伤治疗作用的实验研究高伟东。李晓冬解剖学研究2010年第32卷第1期