第九章环境监测中的微生物学方法

第一章环境监测中的微生物学方法当环境受到污染后，环境的物理性质化学性质生物学特性如：重金属离子、NO3-浓度增加；水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝；发生变化如何监测？化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但为瞬时值；生物学方法：利用生物种类、数量的变化，生物学特性的改变来监测污染物对环境的影响。可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。一、空气微生物来源空气并非微生物的繁殖场所，空气中缺乏水分和营养，紫外线的照射对微生物也有致死作用。土壤中飞扬起来的灰尘；水面吹起的水雾、人和动物体表干燥脱落的物质，微生物附着于这些物质的微粒上随气流传播。第一节空气的卫生学检验微生物产生的孢子本身也可以飘浮到空气中，形成“气溶胶”，借风力传播。空气中的微生物中，真菌的孢子数量最多，细菌较少。而且藻类、酵母菌、病毒都会存在于空气中。二、空气微生物的卫生标准目前，还无统一的关于空气的卫生学指标，一般以室内1m3空气中细菌总数为50~1,000个以上作为空气污染的指标。病原菌在空气中一般很易死亡，但结核菌、白喉杆菌、葡萄球菌、链球菌、肺炎双球菌、炭疽杆菌、流感病毒和脊髓灰质炎病毒等，也可以在空气中存活一段时间。尘埃多的地方，如畜舍、公共场所、医院、城市街道的空气中，微生物数量较多。高山、海洋、森林、积雪的山脉和高纬度地带的空气中，微生物较少。场所畜舍宿舍城市街道市区公园海洋上空北纬80º微生物(1~2)1062×1045×1032001~20表2-1不同场所上空微生物的数量（个/m3）表2-2以细菌总数评价空气的卫生标准（个/m3）清洁程度细菌总数最清洁的空气（有空调）1~2清洁空气30普通空气31~125临界环境~150轻度污染300严重污染301三、空气的微生物监测通常采用营养琼脂平板计数法。我国检测空气微生物所用的培养皿直径为d90mm，有用d100mm的。评价空气的清洁程度，需要测定空气中的微生物数量和空气污染微生物。测定的细菌指标有细菌总数和绿色链球菌，在必要时则测病原微生物。(一)空气微生物的测定方法1．固体法固体法有平皿落菌法(沉降—平板法)、撞击法(有缝隙采样器、筛板采样器、针孔采样器)和过滤法。(1)平皿落菌法：将营养琼脂培养基融化倒人d90mm无菌平皿中制成平板。将它放在待测点(通常设5个测点)，打开皿盖暴露于空气5~10min，以待空气微生物降落在平板表面上，盖好皿盖，置于培养箱中培养48h后取出计菌落数，即为落菌数。可通过前苏联奥梅梁斯基公式换算出浮游细菌数。奥氏认为：5min内落在面积100mm2营养琼脂平板上的细菌数和10L空气中所含的细菌数相同。奥氏公式：式中：C—空气细菌数；A——捕集面积，cm2；t——暴露时间，min；N——菌落数，个。5t100A100010×N××C=简化后的奥氏公式：经测定发现，用奥式公式计算的浮游细菌数比实测的浮游细菌少。此公式没有考虑尘埃粒子大小、数量、气流情况、人员密度和活动情况。C=1000×50NA×t(2)撞击法：以缝隙采样器为例，用吸风机或真空泵将含菌空气以一定流速穿过狭缝(狭缝宽有0.15mm、0.33mm和1mm三种)而被抽吸到营养琼脂培养基平板上。狭缝长度为平皿的半径，平板与缝的间隙有2mm，平板以一定的转速(1r／min、5-60r／min、60r／min)旋转。通常平板转动一周，取出置于37℃恒温箱中培养48h，根据空气中微生物的密度可调节平板转动的速度。采集含菌高的空气样品时，平板转动的速度要比含菌量低的空气样品的转速快。根据取样时间和空气流量算出单位空气中的含菌量。采样器的规格各国不一，可按说明书操作。撞击法检测空气中微生物数量培养前培养后2液体法液体法用于测定空气中的浮游微生物，主要是浮游细菌。该法将一定体积的含菌空气通入无菌蒸馏水或无菌液体培养基中，依靠气流的洗涤和冲击使微生物均匀分布在介质中，然后取一定量的菌液涂布于营养琼脂平板上，或取一定量的菌液于无菌培养皿中，倒入15-18ml融化(45℃)的营养琼脂培养基，混匀，待冷凝制成平板，置于37℃恒温箱中培养48h，取出计菌落数。再以菌液体积和通入的空气量计算出单位体积空气中的细菌数。例如：将10m3含菌空气通入100mL的无菌水中，使10m3空气中的微生物全部截留在100mL水中。然后取0.1mL菌液涂布于平板上，若长出100个菌落，10mL水中共含菌10,000个，则10m3空气含有10,000个。1m3空气含有1,000个。(二)空气微生物的检测点数空气微生物的测点数越多越准确，为照顾到工作方便，又相对准确，以20~30个测点数为宜，最少测点数为5~6，见表。时间标准名称最少测点数建议测点数点距（m）每点测定次数1987JISB9920洁净室中浮游粒子测定方法和洁净室的评价方法620，30原则上3空间太大可放宽≥31987空气清净协会标准洁净室性能评价指南520,30原则上3表2.1日本有关标准测点数的规定摘自许钟麟．空气洁净技术原理．P522．同济大学出版社，1998表2.2按美国联邦标准209E方法计算的必要测点数洁净度进风面积(单向流)或室面积(乱流)／m2100级及高于100级1000级10000级100000级10102040801002004002~348163240801602361325326312622248102040222223613表2.3浮游菌最小采样量浮游菌上限浓度／个·m-2·min-1计算最小采样量／m310510.50.10.050.30.6363060表2.4落菌法测细菌所需要的最少培养皿数(沉降0.5h)含尘浓度最大值需要d90mm培养皿数0.353.5353503500~350004013421第二节水质的细菌学检验一、细菌总数是将定量水样（原水样或经一定稀释后的水样1mL）接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板上，于37ºC培养24hr后观察结果，计算细菌菌落数，最后算出原水样每毫升的细菌总数。具有相对的卫生学意义，菌数越高，反映出水体受有机物污染或粪便污染越重，病原菌污染的可能性亦大。二、粪便污染指示菌人畜粪便中常常带有大量的微生物，其中有些属于正常的、对人体无害的肠道微生物，有些则是病原微生物，进入水体后，可造成水体的污染，从而引发各种肠道疾病。因此，水质的卫生学检验，对于保护人群健康，具有重要意义。致病菌数量少，检测比较复杂，故选用间接指标即粪便污染的指示菌为代表。常用肠道正常细菌在水中的存在及数量情况作为粪便污染的指示。健康成人粪便内的微生物数量微生物名称每克粪便中平均生长菌落数主要微生物拟杆菌属1010乳酸杆菌属109大肠埃希氏菌属108粪链球菌108次要的微生物柠檬酸杆菌属105-106梭菌属105-106葡萄球菌属105-106克雷伯氏菌属104-105肠杆菌属104-105芽孢杆菌属酵母属104-105霉菌104-105较少的微生物变形菌属102-103铜绿假单胞菌属102-103（一）指示菌的理想条件1.大量存在于人的粪便中，且数量比病原菌多；2.受粪便污染的水中易检测出该指示菌，未受污染的水中无此菌；3.在水体中不会自行繁殖；4.存活时间略长于致病菌，对消毒剂的抵抗略强于致病菌；5.检出及鉴定方法比较简易迅速；6.适用于各种水体。（二）适宜的指示菌总大肠菌群，粪大肠菌群、大肠杆菌埃希氏菌（大肠杆菌）、克雷伯氏菌属。三、大肠杆菌（一）特征定义：一群需氧或兼性厌氧性的G-无芽孢杆菌，能在37ºC培养24hr使乳糖发酵产酸产气，包括了粪便内全部兼性需氧性的G-杆菌，以大肠杆菌埃希氏菌属为主，尚有柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等。成人每日粪便中排出的菌数可达(5~100)×106个。（二）大肠菌群的测定常用多管发酵法与滤膜法：1.发酵法：又称多管发酵法或三步发酵法1)初发酵（推测试验）：将不同稀释度的水样，分别接种于含有乳糖等糖类的培养液中（3倍或1倍乳糖液），经37ºC培养24hr，观察产酸产气情况，以初步判断是否有大肠菌群存在。2）平皿分离（证实试验）水中除大肠菌群外，尚有其它细菌可能引起糖类发酵，因此需要进一步证实。将初发酵管中已发酵的菌液接种于伊红美兰培养基或远藤氏培养基上，37ºC培养24hr，根据菌落特征，挑取可能为大肠菌群的菌落制片，经革兰氏染色，进一步证实是否为大肠菌群。3）复发酵试验（完成试验）将上述可能为大肠菌群的菌落再次转接入1倍乳糖培养液中，经37ºC培养24hr，产酸产气者即最后确证为存在大肠菌群。产酸、产气分别记为阳性反应，不产酸、产气则记为阴性反应；根据阳性管数量，查表求得水体大肠菌群的数量。2滤膜法发酵法全部检测需要的时间较长，为缩短时间，可以采用滤膜法，其步骤为：1）水样过滤：选用具有微孔的滤膜，灭菌后通过抽滤一定量的待测水样，将水中的细菌截留在无菌滤膜上；2）培养：将滤膜有菌面朝上贴于特定的固体培养基平板上（伊红美兰培养基或远藤氏培养基），经37ºC培养16hr~18hr；3）结果观察：培养16hr~18hr后，挑选深红色或紫红色、不带或带有金属光泽的菌落，或者淡红色、中心色较深的菌落进行革兰氏染色观察，确定大肠菌群细菌。G-：接入乳糖培养液中，复发酵；G+：阴性结果。经染色证实为G-无芽孢杆菌者，再接入乳糖蛋白胨半固体培养基中，37ºC培养6~8hr，产气者判定为大肠菌群阳性。4）结果计算：根据滤膜上证实的大肠菌群数及滤过水量，求出1L水中的大肠菌群数量。计算公式：总大肠菌群数=滤膜上的菌落数以20~60个/片为适宜。5）评价报告：根据测定的数值写出检测水样的细菌学检测结果，予以评价。滤膜上生长菌落数×1000过滤水样量（mL）滤膜法的优点：省时、省料、设备要求低；可以采集较多的检验水样。局限性：易受悬浮物干扰；受其它细菌的干扰；受水样中毒物的干扰。