第五章分子生物学研究方法（上）——生物大分子操作技术ppt

南京农业大学生命科学学院分子生物学2019/8/16南京农业大学生命科学学院2第五章分子生物学研究法（上）——DNA、RNA及蛋白质操作技术2019/8/162南京农业大学生命科学学院2019/8/16南京农业大学生命科学学院3第五章分子生物学研究法（上）2019/8/163南京农业大学生命科学学院从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。2019/8/16南京农业大学生命科学学院4第五章分子生物学研究法（上）2019/8/164南京农业大学生命科学学院基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。2019/8/16南京农业大学生命科学学院5第五章分子生物学研究法（上）内容：1.重组DNA技术回顾2.DNA基本操作技术3.RNA基本操作技术4.基因克隆技术5.蛋白质组与蛋白质组学技术2019/8/165南京农业大学生命科学学院2019/8/16南京农业大学生命科学学院6第一节重组DNA技术回顾2019/8/166南京农业大学生命科学学院三大成就40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。2019/8/16南京农业大学生命科学学院72019/8/16南京农业大学生命科学学院7重组DNA技术历史上的主要事件年份事件1869FMiescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1944O.T.Avery证实DNA是遗传物质。1952A.D.Hershey和M.Chase再次证实和噬菌体的遗传物质是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子结构的双螺旋模型。M.Wilkins用X-射线衍射法证实了这一结构。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留复制模型。1959-1960S.Ochoa发现RNA聚合酶和信使RNA，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一相遗传密码；F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。1964C.Yanofsky和S.Brenner等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。2019/8/16南京农业大学生命科学学院82019/8/16南京农业大学生命科学学院81965S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由质粒DNA所决定。1966M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破译了全部遗传密码。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977F.Sanger与A.Maxam、W.Gilbert等人发明了DNA序列测定技术。1977年完成了全长5387bp的噬菌体φ174基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以专利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster获得转基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到转基因果蝇。2019/8/16南京农业大学生命科学学院92019/8/16南京农业大学生命科学学院91982美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。1983获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。1986GMO首次在环境中释放。1988J.D.Watson出任人类基因组计划首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠--Oncomouse。1992欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组(1.25×107bp)全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完成第一个高等植物拟南芥的全序列测定。2001完成第一个人类基因组全序列测定。2004中国科学家完成家蚕基因组全序列测定。2005中、美、日科学家联合完成基因组全序列测定。2019/8/16南京农业大学生命科学学院10第一节重组DNA技术回顾重组DNA的核心是用限制性核酸内切酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割和连接。限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。早在1967年，世界上有5家实验室几乎同时报道了DNA连接酶。2019/8/1610南京农业大学生命科学学院2019/8/16南京农业大学生命科学学院11几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切末端2019/8/16南京农业大学生命科学学院12DNA连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体。a.DNA的粘性末端；b.DNA的平末端；c.化学合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。2019/8/16南京农业大学生命科学学院13第一节重组DNA技术回顾仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆的载体。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖2019/8/1613南京农业大学生命科学学院2019/8/16南京农业大学生命科学学院14第一节重组DNA技术回顾限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3′-5′磷酸二酯键DNA聚合酶Ⅰ探针标记、补平3′末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5′磷酸化、探针标记末端转移酶3′末端多聚尾碱性磷酸酶3′切除末端磷酸基DNA外切酶Ⅲ3′末端切除单核苷酸λ噬菌体DNA外切酶5′末端切除单核苷酸重组DNA实验中常见的主要工具酶2019/8/16南京农业大学生命科学学院15第二节DNA操作技术1.核酸凝胶电泳技术自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。基本原理：生物大分子在一定pH条件下，通常会带电荷。将其放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。分子在电场作用下的迁移速度，与电场强度和电泳分子所携带的净电荷数成正比，与分子的摩擦系数成反比。摩擦系数是分子大小、极性及介质粘度的函数。根据分子大小、构型或形状的差异和带净电荷数，可通过电泳将蛋白质或核酸分子混合物中的各种成分彼此分离。2019/8/16南京农业大学生命科学学院16第二节DNA操作技术1.核酸凝胶电泳技术在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈离子化状态，DNA和RNA多核苷酸链称为多聚阴离子，把它们放置在电场当中，会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离DNA片段的基本原理。2019/8/16南京农业大学生命科学学院17第二节DNA操作技术1.核酸凝胶电泳技术琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地检测出来。2019/8/16南京农业大学生命科学学院18第二节DNA操作技术溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中DNA的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。2019/8/16南京农业大学生命科学学院19第二节DNA操作技术普通的琼脂糖凝胶电泳，很难分离大于50kb的DNA分子，而要进行超大分子研究，要用到脉冲电场凝胶电泳。2019/8/16南京农业大学生命科学学院20第二节DNA操作技术2.细菌转化与目标DNA分子的增殖所谓细菌转化，是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。将快速生长中的大肠杆菌置于经0℃预处理的低渗氯化钙溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，与外源DNA形成粘附在细胞表面的复合物。42℃下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。2019/8/16南京农业大学生命科学学院21第二节DNA操作技术2.细菌转化与目标DNA分子的增殖细菌转化方法除了上述的CaCl2还有电击法，利用电脉冲使细胞膜穿孔，外源DNA进入从而实现转化。利用噬菌体颗粒能够有效将DNA注入到宿主细胞这一特点，科学家又发明了DNA分子的体外包装法。如右图2019/8/16南京农业大学生命科学学院22第二节DNA操作技术3.聚合酶链式反应聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。基本原理：首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子，DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。新合成的DNA链的起点，由加入到反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火决定的。DNA解链(变性)、引物与模板DNA相结合(退火)、DNA合成(延伸)三步，被不断重复。多次循环之后，反应混合物中所含有的双链DNA数，即两条引物位点之间的DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。2019/8/16南京农业大学生命科学学院23第二节DNA操作技术3.聚合酶链式反应具体过程：首先将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温（约94℃）环境下加热1min，使双链DNA变性，形成单链模板DNA；然后降低反应温度（约56℃）冷却1min，使引物与两条单链模板DNA发生退火作用并结合在靶DNA区段两端互补序列位置上