第五章微生物的生长及其控制

科技论文的写作格式标题摘要关键词ABSTRACTKeywords前言（其中要概论出目前的动态、存在的问题、关键是研究的意义）1材料与方法（使用的材料、药品、具体的实验方法）2结果和分析（论文的核心，要详细分析结果）3讨论（结论）报告方式：1礼貌用语：问候语，讲出报告的题目。2控制速度、表达清楚流利、观点明确、结果可信。3答问：礼貌对待每一个问题，能准确地、流利地回答问题。4分班讨论完后，每个班推出3~4名优秀者一起集体讨论，老师全面考虑挑选决定出报告者，通知到参加大班报告的同学要认真准备发言，为每一个同学提供最好的科技信息。目的：（1）学会查阅科技文献，并在大量阅读文献的基础上要总结出核心；（2）提高书面表达能力，学会写作科技论文；（3）提高口头表达能力；（4）促进分析问题、解决问题的能力，学会实际利用知识解决问题；（5）学会评价他人学术观点的能力。（6）通过该方式的培养，协同提高智力和能力。题目：1“风险评估RiskAnalyses”在食品安全和质量控制中应用现状2鱼类的生物安全加工技术的研究3现代化酱油的发酵技术研究4诺维信酶制剂的研究动态5花椒麻味成分的定量化研究现状6辣椒辣味成分与辣度关系定量化研究现状7国际食品法典（CAC，CodexAlimentariusCommission）标准体系概况。8豆瓣产品的微生物安全问题9鱼制品的微生物安全问题10国内外关于辐照食品的安全问题第五章微生物的生长及其控制第一节微生物生长1微生物生长的概念2微生物生长量的测定3微生物群体生长的规律第二节影响微生物生长的因素1物理因素对微生物生长的影响2化学因素对微生物生长的影响第三节微生物生长的控制1.控制微生物生长的物理方法2.控制微生物生长的化学方法第一节微生物生长1微生物生长的概念微生物在适宜的外界环境条件下，不断地吸收营养物质，并按自身的代谢方式进行新陈代谢，如同化作用大于异化作用，其结果是原生质的总量（包括重量、体积、大小）不断地增加，称为微生物的生长现象。生长定义为微生物细胞在群体水平上增加，也可以认为是微生物群体数量增加。许多微生物是以二分裂的方式生长的。一般细胞分裂和染色体复制是协调控制的。单细胞微生物如细菌的生长，往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时，就以二分裂方式，形成两个相似的子细胞，子细胞又重复上述过程，使细胞数目增加，称为繁殖。在多细胞微生物中，例如某些霉菌，细胞数目的增加如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长，不能叫繁殖。例如菌丝细胞的不断延长或分裂产生同类细胞均属生长，只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。在一般情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育。生长是细胞逐步发生的量变过程，繁殖是产生新的细胞个体的质变过程，伴随着细胞总数的增加。个体生长→个体繁殖→群体生长群体生长=个体生长+个体繁殖微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体生长很难测定，意义也不大。通常测定微生物的生长是测群体的生长，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。测生长量的方法如下：测定生长量的方法有许多种，适用于一切微生物。2生长量的测定：一、直接法1．测体积它是一种较为粗放的方法，例如将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。2．称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10~20%。如用离心法，将待测培养液离心，再用清水洗涤离心1~5次后干燥，可用105℃、100℃或红外线烘干，也可在较低的温度（80℃或40℃）下进行真空干燥，然后称干重。如细菌一个细胞一般重10-12~10-13g。如为丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少量水洗涤，再真空干燥（40℃以下），称干重。以乳酸菌为例，在液体培养基中，细胞的浓度大约为2×108个/ml。100ml培养物可得10~70mg干重的细胞。二、间接法1、生理指标法与生长量相平行的生理指标很多，它们均可用作生长测定的相对值。（1）测定细胞总含氮量来确定细菌浓度大多数细菌的含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%。总氮量与细胞粗蛋白的含量（因其中包括了杂环氮和氧化型氮）的关系可用下式计算：粗蛋白总量=含氮量%×6.25含氮量的测定方法有很多，常用凯氏定氮法。此法适用于细胞浓度较高的样品，同时操作过程也较麻烦，主要用于科学研究中。（2）含碳量的测定微生物新陈代谢的结果，必然要消耗或产生一定量的物质，以表示微生物的生长量。一般生长旺盛时消耗的物质就多，或者积累的某种代谢产物也多。将少量生物材料混入1ml水或无机缓冲液中，用2ml2%重铬酸钾溶液在100℃下加热30分钟，冷却后，加水稀释至5ml，在580nm波长下测定光密度值（用试剂作空白对照，并用标准样品作标准曲线），即可推算出生长量。（3）其它磷、DNA、RNA、ATP和N–乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、产CO2（用标记葡萄糖作基质）、耗氧、粘度和产热等指标，均可用于生长量的测定。2、比浊法微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物混浊度的增高。最古老的比浊法是采用McFarland比浊管，用不同浓度的Bacl2与稀H2SO4配制成的10支试管，其中形成的BaSO4有10个梯度，表示10个相对的细菌浓度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。精确的测定，要用分光光度计进行。在可见光的450~650nm波长内均可测定。三、计数法计数法即是计算微生物繁殖出的个体数目，此法适宜于单细胞状态的微生物或丝状微生物所产生的孢子。（一）直接法直接法即是在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，其计数结果是包括死细胞在内的总菌数。1、比例计数法是一种粗放的计数方法。将已知颗粒（例如霉菌的孢子或红细胞等）浓度的液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合，然后镜检各自的数目，求出未知菌液中的细胞浓度。2、血球计数板法计数一定容积中的细胞总数的常用方法，此法对细胞较大的酵母菌较为适用。详细方法见实验指导书。（二）间接法是一种活菌计数法，其原理是活菌在液体培养基中生长繁殖使液体混浊，在固体培养基表面形成菌落，然后计数活菌的方法。1、平板菌落计数法是一种常用的食品中细菌总数的计数法，有标准方法将待测样品稀释，然后取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀，凝固后培养，然后计数平板上出现的菌落数乘以样品的稀释度，即可计算出样品的含菌数。也可用涂布法将稀释样品接种在凝固的平板培养基上，后续方法同前。此法的优点是检测的结果较为精确，缺点是方法烦琐，获得检测结果的时间长。血球计数板方法48+2h36+1℃检样做成几个适当倍数的稀释液选择2～3个适宜稀释度，各以1ml量加入灭菌平皿内每皿内加入适量营养琼脂菌落计数结果菌落总数实验程序计数的方法GB方法培养的温度、时间严格生长的特殊性要求计数范围在30—300之间的菌落，当大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘上稀释倍数呈片状生长的菌落超过培养皿的一半不能计数当其两个稀释度都在30-300间，二者的比值大于2时，以其中小的数报告当其两个稀释度的比值小于或等于2时，以应报告其平均数实验次数稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数个/g或ml报告方式个/g或ml10-110-210-31234567多不可计数多不可计数多不可计数多不可计数270多不可计数164295271多不可计数1103052046603135012-1.62.2----164003775027100313000270﹤1×10305001.6×1043.8×1042.7×1043.1×1052.7×102﹤103.1×104检样稀释乳糖胆盐发酵管(36+1℃,24+2h)不产气大肠菌群阴性报告产气伊红美兰琼脂平板(36+1℃,24+2h)↓(24+2h,36+1℃)革兰氏染色乳糖发酵管(36+1℃,24+2h)革兰氏染色阳性革兰氏阴性无芽胞杆菌产气不产气大肠菌群阴性报告大肠杆菌阳性报告大肠菌群阴性报告图29-1大肠菌群检验程序2、液体稀释法对未知样品作10倍系列稀释。选适宜的3个连续的10倍稀释液各取3ml，接种到3组共9支液体培养基试管中，每管接入1ml，培养一定的时间后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN（mostprobablenumber，最近似数）表，根据样品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。3、细胞混浊度的测定估计细胞数目和粗重的一较快和适用的方法是使用混浊度测定法。一个细胞悬浮液用肉眼观察是呈现浑浊的，这时因为光线通过悬浮液时，细胞散射光线。存在的细胞数越多，分散的光线就越多，因此悬浮液浊度就越大。可以用光度计或分光光度计测量混浊度，分光光度计和光度计射出的光线通过细胞悬浮液时，就可以检测出没有被细胞散射的光线。3微生物群体生长的规律微生物的群体生长规律单细胞的微生物，如细菌、放线菌在液体培养基中，可以均匀地分布，每个细胞接触的环境条件相同，都有充分的营养物质，故每个细胞都迅速地生长繁殖。霉菌多数是多细胞微生物，菌体呈丝状，在液体培养基中生长繁殖的情况与单细胞微生物不一样，如果采取摇床培养，则霉菌在液体培养中的生长繁殖情况，近似于单细胞微生物。因液体被搅动，菌丝处于分布比较均匀的状态，而且菌丝在生长繁殖过程中不会像在固体培养基上那样有分化现象，孢子产生也较少。（1）典型的生长曲线微生物生长繁殖的速度非常快，一般细菌在适宜的条件下，大约20~30分钟就可以分裂一次，如果不断迅速地分裂，短时间内可达惊人的数目，但实际上是不可能的。在培养条件保持稳定的状况下，定时取样测定培养液中微生物的菌体数目，发现在培养的开始阶段，菌体数目并不增加，一定时间后，菌体数目就增长很快，继而菌体数目增长速度保持稳定，最后增长速度逐渐下降以致等于零。如果以培养时间为横坐标，以单细胞增长数目的对数值作纵坐标，就可作出一条生长曲线。这生长曲线（growthcurve）代表单细胞微生物从生长开始到衰老死亡的一般规律。根据微生物的生长速率常数（growthrateconstant），即每小时的分裂代数的不同，一般把典型的生长曲线粗分为延滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个时期。（一）延滞期（lagphase）又叫适应期、缓慢期或调整期，是指把少量微生物接种到新培养液刚开始的一段时间细胞数目不增加的时期，甚至细胞数目还可能减少。延滞期有如下特点：（1）生长的速率常数为零。（2）细胞的体积增大，DNA、含量增多为分裂做准备。（3）合成代谢旺盛，核糖体、酶类和ATP的合成加快，易产生诱导酶。（4）对不良环境敏感，例如pH、NaCl溶液浓度、温度和抗生素等化学物质。发酵工业中常常要采取措施缩短延滞期，其方法主要有：（1）以对数期的菌体作种子菌，（2）适当增大接种量，生产上接种量的多少是影响延滞期的一个重要因素，接种量大，延滞期短，接种量小，则延滞期长。一般采用3~8%的接种量，最高不超过1/10。（3）培养基的成分为了缩短培养基的营养成分差异，常常在种子培养基中加入生产培养基的某些营养成分，即是种子培养基尽量接近发酵培养基。（二）对数期（logarithmicphase）又叫指数期，指在生长曲线中，紧接着延滞期后的一段时期。此时菌体细胞生长的速率常数R最大，分裂快，细胞每分裂繁殖一次的增代时间（即代时，generationtime）短，细胞进行平衡生长，菌体内酶系活跃，代谢旺盛，菌体数目以几何级数增加，细胞以惊人的速度产生，群体的形态与生理特征最一致，抗不良环境的能力强。图3-12生长曲线中的指数期在对数期中，以下三个参数尤为重要。(1)繁殖代数（n）由生长曲线图可以得出。P134(2)生长速率常数（R）如前所述生长速率常数的定义的可知。(3)代时（G）如前所述平均代时的定义可知。影响微生物对数期增代时间的因素较多，主要有：（1）菌种：不同微生物代时差别大