第八章真核生物的基因调控

1第八讲真核生物的基因调控一、真核生物的基因结构特点①在真核细胞中，一条成熟的mRNA链只能翻译出一条多肽链，不存在原核生物中常见的多基因操纵子形式。②真核细胞DNA都与组蛋白和大量非组蛋白相结合，只有一小部分DNA是裸露的。③高等真核细胞DNA中很大部分是不转录的，大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。④真核生物能够有序地根据生长发育阶段的需要进行DNA片段重排，还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。⑤在真核生物中，基因转录的调节区相对较大，它们可能远离启动子达几百个甚至上千个碱基对，这些调节区一般通过改变整个所控制基因5'上游区DNA构型来影响它与RNA聚合酶的结合能力。在原核生物中，转录的调节区都很小，大都位于启动子上游不远处，调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑RNA聚合酶与它的结合。⑥真核生物的RNA在细胞核中合成，只有经转运穿过核膜，到达细胞质后，才能被翻译成蛋白质，原核生物中不存在这样严格的空间间隔。⑦许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程（maturationandsplicing），才能顺利地翻译成蛋白质。二、真核生物的转录特点原核生物中，密切相关的基因往往组成操纵子，并且以多顺反子mRNA的方式进行转录，整个体系置于一个启动子的控制之下。真核生物的DNA是单顺反子，很少有置于一个启动子的控制之下的操纵子。真核生物中许多相关的基因按功能成套组合，被称为基因家族（genefamily）。1、基因家族一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因。可能由某一共同祖先基因(ancestralgene)经重复(duplication)和突变产生。基因家族的特点：①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(genecluster)或串联重复基因(tandemlyrepeatedgenes)，它们可同时发挥作用，合成某些蛋白质，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，这些不同成员编码一2组功能上紧密相关的蛋白质，如珠蛋白基因；③有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene)。假基因与有功能的基因同源，原来可能也是有功能的基因，但由于缺失，倒位或点突变等，使这一基因失去活性，成为无功能基因。与相应的正常基因相比，假基因往往缺少正常基因的内含子，两侧有顺向重复序列。人们推测，假基因的来源之一，可能是基因经过转录后生成的RNA前体通过剪接失去内含子形成mRNA，如果mRNA经反复转录产生cDNA，再整合到染色体DNA中去，便有可能成为假基因，因此该假基因是没有内含子的，在这个过程中，可能同时会发生缺失，倒位或点突变等变化，从而使假基因不能表达。1）简单基因家族2）复杂基因家族海胆，5个基因组成串联单位，可以重复1000次。串联单位中的每个基因分别被转录成单顺反子RNA，这些RNA都没有内含子，而且各基因在同一条DNA链上按同一方向转录，每个基因的转录与翻译速度都受到调节。3）发育调控的复杂基因家族在生物个体不同发育阶段，出现几种不同形式的α和β亚基。人的α－珠蛋白基因簇位于16号染色体短臂上，其中ζ为胚胎期基因；β－珠蛋白基因簇位于11号染色体短臂上，其中ε为胚胎期基因，Gγ和Aγ为胎儿型基因，δ和β为成人期基因。在每个基因家族中，基因排列的顺序就是它们在发育阶段的表达顺序。原始珠蛋白大约产生于8亿年前，由单基因编码，现代珠蛋白基因家族是由同一个原始基因通过一系列重复、突变和转位演变而成的。随着物种的进化，动物的体积相对变大，对氧的需求量越来越大，在进化压力下，血红蛋白基因通过自发突变产生杂合基因，编码出对氧的结合和释放能力要大大高于单分子血红蛋白的四聚体。在哺乳动物的进化中，β链基因又发生突变和重复，形成了胎儿中的ε和γ型珠蛋白。胎儿血红蛋白对氧的亲和力比成人更大，因而利于胎儿得快速发育。4）假基因1977年，G·Jacp在对非洲爪赡5SrRNA基因簇的研究后提出了假基因的概念，这是一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋白质的失活基因。假基因的发现是真核生物应用重组DNA技术和序列分析的结果。现已在大多数真核生物中发现了假基因，如Hb的假3基因、干扰素、组蛋白、α球蛋白和β球蛋白、肌动蛋白及人的rRNA和tRNA基因均含有假基因。由于假基因不工作或无效工作，故有人认为假基因，相当人的痕迹器官，或作为后补基因。除了多种多样的遗传缺陷外，大多数返座假基因具有以下4个较鲜明的特征：a)完全缺失存在于功能基因中的间隔序列，即内含子序列；b)假基因的序列只与功能基因转录产物的起点和终点之间的序列相似，而与其5’端调控序列无关。但是鼠Ψα3-珠蛋白假基因［7］，鼠促皮质素-β-脂蛋白前体假基因［8］、人免疫球蛋白ε及λΨ1假基因［9，10］是其中的例外；c)假基因的3’末端紧接着有多聚腺嘌呤尾。以上3个特征明显提示这些序列是从成熟mRNA衍生而来，因此这类假基因又被称为处理后的假基因(图1)。d)这类假基因的序列两端常被7～21bp的正向重复序列包围。这种正向重复序列也在snRNA假基因家族和AluⅠ家族中被发现，提示正向重复序列的产生可能是一种共同的插入机制的结果。通过分析基因组序列发现，基因组中存在着与基因数量几乎相等的假基因，假基因是功能基因的缺陷拷贝。在过去的几十年中，假基因一直被认为是分子化石，是进化中基因突变的遗迹。而2003年5月日本学者Hirotsune的报导第一次揭示了假基因的功能。Hirotsune等人将果蝇的sex－lethal基因转移到小鼠体内，大多数小鼠表现正常，但有一个品系的小鼠在幼年期全部死亡。进一步研究发现，sex－lethal基因插入到makorin1－p1假基因中部，破坏了该假基因的转录。makorin1－p1是makorin1基因的假基因。如果将假基因makorin1－p1敲除，makorin1基因将被关闭。这说明，基因makorin1的表达受到其同源序列假基因的控制。2、DNA水平调控1）染色质结构影响基因转录细胞分裂时染色体的大部分到间期时松开分散在核内，称为常染色质（euchromatin），染色质常常会在特定的区域被解旋松弛，形成自由的DNA，DNA本身局部结构发生变化，导致结构基因暴露，促进转录因子与启动区DNA的结合，诱发基因转录。松散的染色质中的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后不像其他部分解旋松开，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质（hetrochromatin），其中从未见有基因转录表达。原本在常染色质中表达的基因如移到异染色质内也会停止表达；哺乳类4雌体细胞2条X染色体，到间期一条变成异染色质者，这条X染色体上的基因就全部失活。可见紧密的染色质结构阻止基因表达。常染色质(euchromatin)：指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低,处于伸展状态（典型包装率750倍）,用碱性染料染色时着色浅的那些染色质。常染色质是进行活跃转录的部位，呈疏松的环状，电镜下表现为浅染。并非所有基因都具有转录活性,常染色质状态只是基因转录的必要条件而非充分条件异染色质(heterochromatin)：指间期细胞核中,折叠压缩程度高,处于聚缩状态，碱性染料染色时着色较深的染色质组分。类型结构异染色质（或组成型异染色质）(constitutiveheterochromatin)兼性异染色质(facultativeheterochromatin)结构异染色质，除复制期以外，在整个细胞周期均处于聚缩状态，形成多个染色中心。结构异染色质的特征：在中期染色体上多定位于着丝粒区、端粒、次缢痕及染色体臂的某些节段；由相对简单、高度重复的DNA序列构成,如卫星DNA；具有显著的遗传惰性,不转录也不编码蛋白质；在复制行为上与常染色质相比表现为晚复制早聚缩兼性异染色质在某些细胞类型或一定的发育阶段,原来的常染色质聚缩,并丧失基因转录活性,变为异染色质，如X染色体随机失活。异染色质化可能是关闭基因活性的一种途径。▲DNase的敏感性和基因表达研究发现，活跃表达基因所在染色体上一般含有一个或数个DNA酶Ⅰ超敏感位点，超敏感位点的产生可能什染色质结构规律性变化的结果。正是这种变化，使DNA容易与RNA聚合酶和其它转录调控因子相结合，从而启动基因表达，同时更易于被核酸酶所降解。当一个基因成为转录活性状态时，含有这个基因的染色质区域对DNaseⅠ（一种内切酶）降解的敏感性要比无转发活性区域高得多。这是由于此区域染色质的DNA蛋白质结构变得松散，DNaseⅠ易于接触到DNA之故。一个很好的研究系统是鸡的珠蛋白和卵清蛋白系统。来自鸡胚红细胞5的核中，珠蛋白的基因对DNaseⅠ的降解是敏感的，而编码卵清蛋白的基因在红细胞中是不表达的，它对DNaseⅠ的降解也是具有抗性的。相反，在母鸡输卵管细胞的核中，卵清蛋白的基因是具有转录活性的，但却不能产生珠蛋白的RNA，卵清蛋白基因的序列对DNaseⅠ的降解要比珠蛋白基因的序列敏感得多。很多实验得出的结论几乎都是有转录活性的基因对DNaseⅠ的敏感性增加，DNaseⅠ敏感区的范围随着基因序列的不同而变化，从基因周围几个Kb到两侧20Kb大小不等。仔细分析具有转录活性基因周围的DNA区域，表明有一个中心区域存在，称为超敏感区域（hypersensitiveregion）或超敏感位点（hypersensitivesite），它对DNaseⅠ是高敏感的。这些位点或区域将首先受到DNaseⅠ的剪切。由于对DNaseⅠ的敏感性反映了染色质中DNA的有效性，我们将这些位点描述为染色质中特殊DNA暴露区域，一般在转录起始点附近，即5′端启动子区域，少部分位于其它部位如转录单元的下游。超敏感位点建立于转录起始之前，转录的诱导物除去后虽超敏感位点信然存在，但转录却很快停止，说明超敏感位点的存在是转录起始的必要条件，但不是充分条件。超敏感位点是一段长200bp左右的DNA序列，这些区域是低甲基化区；并可能有局部解链的存在；不存在核小体结构或结构不同寻常，此区因DNA的裸露易和多种酶或特异的蛋白质结合，也就是说易于和反式作用因子结合。2)DNA的甲基化和去甲基化A日常型甲基化酶在甲基化的DNA模板指导下使新合成的链甲基化。特异性很强，对半甲基化的DNA有较高的亲和力，使新生的半甲基化DNA迅速甲基化，从而保证DNA复制及细胞分裂后甲基化模式不变。B从头合成型甲基化酶无需模板指导完成甲基化修饰。不需要母链指导，但速度很慢。C在一些不表达的基因中，启动区的甲基化程度很高，而处于活化状态的基因则甲基化程度较低。现以卵黄原蛋白Ⅱ基因为例来说明这个问题。卵黄蛋白并非在卵母细胞或受精卵中合成的，而是在成熟的雌性动物肝中先合成卵黄蛋白原（vetellogenin），然后分泌到血液中，再运送到卵巢。发育中的卵（卵母细6胞）选择性地将卵巢中的卵黄蛋白原加以吸取，再切割，装配成卵黄蛋白。雄性动物也有卵黄蛋白原基因，但不能表达。这是因为缺乏雌激素之故。其分子机制仍和甲基化有关。鸡的卵黄蛋白原基因的5′调节区有4个CpG位点（图18-43），C，D位点是雌二酮受体蛋白复合物的结合部位。在雌激素处理后，在-612（C）的HpaⅡ位点处于低甲基化。在红细胞DNA的上面一股链上4个位点全部甲基化，下股链只有50%甲基化，但经雌二酮处理后数小时内甲基化的形式发生急剧变化，上股链中4个位点全部去甲基化，与卵黄蛋白原mRNA相吻合，而另一股键上4个位点滞后24小时才去甲基化，这就是在肝细胞中卵黄蛋白原基因中的5′端调节区有部分半甲基化位点，而雌激素的处理只引起其中一条链迅速地去甲基化，另一条链暂时仍保持本甲基化状态，所以此基因在雄体中处于甲基化状态，没有活性。酶对CpG位点的甲基化是有选择的，例如小鼠β-珠蛋白基因5′侧翼有5个CpG位点，其中4个较集中。用纯化的DNA甲基转移酶在体外处理这段序列，结果各位点的甲基化程度各不相同，有的不发生甲基化，有的甲基化不明显，有的稍有甲基化，有的