细胞生物学实验课件ppt-PowerPointPres

细胞生物学实验主讲人:康美玲单位:枣庄学院生命科学系实验一血涂片的制备及细胞大小的测量一、实验目的1.掌握血涂片的制备方法；2.认识红细胞及各种白细胞的典型形态；3.掌握显微测微尺的使用方法。二、实验原理涂片技术是制备血液样品最常用的技术。将血液样品制成单层细胞的涂片标本，染色后可对血液中各种细胞形态进行形态观察、细胞计数、细胞大小测量等工作。三、实验用品1.器材:医用一次性采血针、酒精棉球、镊子、经脱脂洗净的载玻片、双凹片（推片）。2.试剂:Wright’s染液：Wright’s色素粉末0.1g，溶于60ml甲醇。四、方法与步骤一.血涂片的制备与血细胞的观察二.显微测微尺的使用采血前用70％酒精棉球消毒人的指腹采血由于第一滴血中含单核白细胞较多，因此弃去第一滴血。推片：挤出第二滴血置于载玻片的右侧再取另一张边缘光滑的双凹片，斜置于血滴的前缘，先向后稍移动轻轻触及血滴，使血液沿玻片端展开成线状。30~45°两玻片的角度以30~45°为宜，轻轻将双凹片向前匀速推进，即涂成血液薄膜。染色待涂片在空气中完全干燥后，滴加数滴Wright’s染液盖满血膜为止，染色3min。然后滴加等量蒸馏水，使其与染液均匀混合，静置5min。用蒸馏水冲去染液，吸水纸吸干，镜检。结果显示淋巴细胞单核细胞嗜中性粒细胞嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞显微测微尺的使用显微测微尺是用来测量在显微镜下所观察到的物体的长度、面积的工具，包括镜台测微尺、目镜测微尺两部分。在使用的过程中，镜台测微尺起标定作用，利用它可以确定目镜测微尺旋钮上每小格代表的实际长度。目镜测微尺标定完成后，即可用于细胞样品的测量。每个大格又可分为10个小格，每小格的实际长度为0.01mm总长0.1mm镜台测微尺总长1mm共分为10格目镜测微尺可以通过旋转旋钮移动目镜测微尺中交叉线的位置使用方法1.取下目镜,将目镜测微尺的刻度面向下放入目镜中,旋上透镜；2.将镜台测微尺盖片面朝上放在载物台上,用低倍镜观察,调节焦距看清镜台测微尺的刻度；3.移动镜台测微尺,同时转动目镜,使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近,并将两尺的“0”点刻度线或某刻度线对齐.然后从左向右查看两尺刻度线另一重合处,记录重合线间目镜测微尺与镜台测微尺的格数.按下式计算目镜测微尺每格等于多少微米。目镜测微尺的标定n×aX=MX:目镜测微尺每格的实际长度a:镜台测微尺每格的实际长度n:镜台测微尺的刻度数。M:目镜测微尺的刻度数。4.移去镜台测微尺，换血涂片，目镜测微尺测量细胞所占小格数X目镜测微尺每小格代表的实际长度=被测细胞的实际长度。实验作业1.绘制各种不同类型的血细胞,并说明它们的主要作用？2.任选20个红细胞，测量其直径，并计算出平均值.CompanyLogo实验二细胞凝集反应一、实验目的：1.学习制备土豆凝集素2.掌握细胞凝集反应的实验方法及细胞凝聚的原理。3.观察凝集的现象二、实验原理①细胞质膜外表面的一层黏性多糖物质构成的细胞全委会被在细胞间的联系和识别、细胞的生长分化、免疫反应及肿瘤发生等过程中发挥着重要作用。②动物细胞表面的糖蛋白、糖脂中的糖链伸向膜表面，它们是细胞识别、细胞免疫及细胞接触抑制现象的必要组分。③凝集素是一类含糖的(少数例外)并能与糖专一性结合的蛋白质，它具有凝集细胞和刺激细胞分裂的作用。凝集使细胞凝集是由于它与细胞表面的糖分子连接，在细胞间形成“桥”的结果。④凝集素与糖分子结合有一定的专一性和结合价，并与细胞膜上受体的分布有关。CompanyLogo三、实验仪器显微镜、粗天平、载玻片、滴管、离心管、离心机等.土豆块茎四、实验材料鸡血细胞五、实验内容与实施过程1.凝集素粗提液制备（50分钟）：用天平称取去皮的土豆块茎2g+10mlPBS缓冲液，浸泡2h→粗提液中含有可溶性土豆凝集素。2.鸡红细胞悬液制备（35分钟）：以无菌方法抽取鸡血注射器中抽取3.8%柠檬酸钠1ml抽取鸡静脉血液2ml，用生理盐水洗5次，每次2000r/min，离心5min，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成2%红细胞液。实验内容与实施过程3.细胞凝集反应现象的观察与讨论（50分钟）：用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍显微镜下观察血球凝集现象。本实验过程很简单，只需要将植物凝集素与红细胞混合后用低倍显微镜观察现象即可。具体如下：实验组凝集素1滴红细胞悬液1滴对照组PBS液1滴红细胞悬液1滴实验内容与实施过程4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。共150分钟。实验作业1.细胞间凝集的原理是什么？2.简图表示血细胞凝集原理.实验总结1.为什么对照组有PBS液作对照呢？没什么巧，因为凝集素中本身含PBS缓冲液，当含本身凝集素是不含PBS的，只是因为本实验中凝集素的提取时用到了PBS.实验总结2.那么红细胞悬液是怎么制备的呢？其实也不难，无菌抽取动物静脉血液，当然血液抽出来后肯定要先加抗凝剂了，然后再加生理盐水。那么怎么从血液中将红细胞分离出来呢？想想，血液中有血清、红细胞、白细胞和血小板，按道理来讲红细胞应该最重吧(有待查证)，用离心机在2000r/min下离心5min，去掉上清液，得到的应该就是红细胞了，再加适量生理盐水洗涤几次后，加一定量是(按压积红细胞体积算)生理盐水即可配成相应浓度的红细胞悬液了。备注凝集素是一类含糖、并能与糖专一结合的蛋白质,被认为与糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控有关。实验三细胞膜的渗透性一、实验目的：了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。二、实验原理细胞膜为一种半透膜，对物质的通透具有选择性。当红细胞放入低渗溶液中时，细胞吸水膨胀而发生溶血。当红细胞放入含不同溶质的等渗溶液中时，由于细胞膜对不同溶质的透性不同，细胞发生溶血的时间也会不同，故发生溶血现象时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。三、实验仪器离心机移液枪试管架试管鸡血四、实验材料鸡血细胞五、实验内容与实施过程1.鸡血细胞悬液的制备：一份鸡血+10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的鸡血。2.低渗溶液：一支试管中，加入10ml蒸馏水+1ml稀释的鸡血，观察溶液颜色的变化？实验内容与实施过程3.鸡红细胞的渗透性观察：在10种等渗溶液中观察细胞溶血现象及时间。实验内容与实施过程4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。实验作业将观察到的现象列入下表，对实验结果进行比较和分析。实验作业试管编号是否溶血时间结果分析1.10ml氯化钠+1ml稀释羊血2.10ml氯化铵+1ml稀释羊血3.10ml醋酸铵+1ml稀释羊血4.10ml硝酸钠+1ml稀释羊血5.10ml草酸铵+1ml稀释羊血6.10ml硫酸钠+1ml稀释羊血7.10ml葡萄糖+1ml稀释羊血8.10ml甘油+1ml稀释羊血9.10ml乙醇+1ml稀释羊血10.10ml丙酮+1ml稀释羊血实验总结溶血时间及现象的观察比较困难，可采用离心辅助的方法来判别鸡血在哪些等渗液中最易溶血，哪些较慢，做一些定性的分析。经过离心之后，若上清液无色，证明在这个时间段血细胞没发生溶血，若上清液略红，证明有溶血发生。当然这个方法不很精确，但却快速、便于观察。实验四线粒体和液泡系的超活染色与观察一、实验目的：1.观察动、植物活细胞内线粒体和液泡系的形态、数量及分布；2.掌握细胞超活染色技术及原理；3.学习一些细胞器的超活染色技术。二、实验原理①活体染色：应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些细胞结构而又很少影响细胞生命活动的染色方法。②中性红：中性红对高尔基体、液泡系的染色具有专一性。只将活细胞中的液泡系当成红色，细胞核与细胞质完全不着色(这可能与液泡系中某些蛋白质有关。③詹纳斯绿B：詹纳斯绿B能专一的对线粒体进行活体染色。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态，即有色状态，呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态三、实验仪器显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。人口腔上皮细胞四、实验材料洋葱、小麦种子或黄豆幼根根尖五、实验内容与实施过程1.人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板上↓滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液↓用牙签口腔颊粘膜处稍用力刮取上皮细胞↓刮下的粘液状物放大载玻片的染液滴中↓染色10-l5min(注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液)↓盖上盖玻片,显微镜下观察实验内容与实施过程2.植物细胞液泡系的超活染色与观察取小麦种子发芽的根尖用刀片纵切根尖放入中性红染液滴中，染色5～10min。吸去染液，滴一滴Ringer液盖上盖玻片进行镜检(镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察)实验内容与实施过程3.实验结果在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。实验内容与实施过程4、实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作得比较好。提醒预习下节课实验内容，提问。实验作业（1）绘口腔上皮细胞示线粒体的形态与分布（2）绘小麦根尖细胞示液泡的形态与分布实验总结人口腔上皮细胞的线粒体的超活染色与观察效果很好，但是洋葱表皮细胞和小麦根尖细胞的染色效果不是很理想。实验五叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的：1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。二、实验原理组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。一个颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。在一给定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速率不同。依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。三、实验仪器普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。烧杯2个,250ml量筒1个,滴管20支,10ml刻度离心管20支,试管架5个，纱布若干，无荧光载片和盖片各4片。新鲜菠菜四、实验材料五、实验内容与实施过程（一）叶绿体的分离与观察1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml0.35mol/LNaCl溶液中，装入组织捣碎机。2.利用组织捣碎机低速(5000r/min)匀桨3-5min。3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。4.取滤液4ml在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。5.将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清液，沉淀即是叶绿体(混有部分细胞核)。实验内容与实施过程6.将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮。7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在显微镜下观察。①在普通光镜下观察。②在荧光显微镜下观察。③取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%丫啶橙荧光染料，在荧光显微镜下观察。实验内容与实施过程（二）实验结果：①普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄形，在高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色小颗粒，即基粒。②在选用B（blue）激发滤片的条件下，叶绿体发出火红色荧光。③加入丫啶橙后，叶绿体可发出橘红色荧光，其中混有的细胞核则发绿色荧光。实验内容与实施过程(三)实验小结（15分钟）：总结实验过程中学生的操作是否规范；实验是否成功，如果不成功，问题出在哪里；哪些实验作