细菌鉴定技术-临床微生物学和微生物学检验

细菌鉴定技术南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生实验课时：4学时课程类型：专业实验课课程要求：必修每组人数：2人实验目的和要求掌握鉴别细菌常用生化反应的原理和结果判定。熟悉鉴别细菌常用生化反应的培养基、方法和意义。熟悉数字编码鉴定技术的原理和结果判断。了解细菌数字编码技术操作和临床意义。实验内容生化反应培养基的制备。常用细菌生化反应。数字编码鉴定。一、生化反应培养基的制备不同生化反应需选择不同生化反应培养基。按相应培养基配方及配制要求，制备所需生化反应培养基。制备方法同培养基制备技术二、常用细菌生化反应糖发酵试验吲哚试验（靛基质试验）甲基红试验V-P（Voges-Proskauer）试验枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验克氏双糖铁（KIA）复合试验动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验1.糖发酵试验【原理】：各种细菌含有不同的分解糖（苷、醇）的酶，对糖（苷、醇）分解能力也各不相同，有的不分解，有的分解后仅产酸，有的分解后产酸产气，故可用来鉴别细菌。【方法】：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种葡萄糖、乳糖发酵管，35ºC培养18-24h观察结果。1.糖发酵试验【结果】：首先确定细菌是否生长，细菌生长者培养基呈混浊状：1）不分解糖，培养基顔色与接种前无变化，以“-”表示；2）分解糖产酸不产气，培养基由紫色变为黄色，以“+”表示；3）分解糖产酸产气，除培养基顔色变化外，倒管中还有气泡，以“⊕”表示。2.吲哚试验（靛基质试验）【原理】：有些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚，与吲哚试剂形成红色化合物。【方法】：大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白胨水培养基中，35ºC18-24h后，加入吲哚试剂数滴，静置分层，观察结果。【结果】：在培养物液面上层呈玫瑰红色为阳性，不变色者为阴性。3.甲基红试验【原理】：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等酸性物质，故培养基pH在4.5以下，加入甲基红指示剂后呈红色（阳性）；有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步化为醇、酮等非酸性物质，使培养基pH在6.2以上，加入甲基红指示剂后呈黄色（阴性）。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种葡萄糖蛋白胨水培养基中，35ºC18-24h，加入甲基红指示剂2-3滴观察结果。【结果】：红色为阳性，黄色为阴性。－+4.V-P（Voges-Proskauer）试验【原理】：某些细菌分解葡萄糖生成丙酮酸，进一步脱羧生成乙酰甲基甲醇，在碱性环境下被氧化成二乙酰，后者与蛋白胨中的精氨酸所含的胍基起作用，生成红色胍缩二乙酰，为VP试验阳性。若培养基中胍基含量少，加入少量含胍基的化合物如肌酐，以加速其反应。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于葡萄糖蛋白胨水中，35ºC，24-48h，加入VP试剂甲液和乙液各1滴，充分摇动，观察。【结果】：红色为阳性，若为阴性应再培养4h观察，仍无红色者为阴性。－+5.枸橼酸盐（或柠檬酸盐）利用试验【原理】：当细菌可以利用铵盐作为唯一氮源，同时柠檬酸盐为惟一碳源时，可在柠檬酸盐培养基上生长，分解柠檬酸盐为碳酸盐，使培养基变碱，指示剂溴麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色为阳性，培养基不变色（绿色）为阴性。【方法】：大肠埃希菌和产气肠杆菌分别接种于柠檬酸盐培养基中，35ºC，24-48h，观察。【结果】：菌苔出现，培养基变为深蓝色为阳性。细菌不能生长，培养基不变色（绿色）为阴性。6.克氏双糖铁（KIA）复合试验【原理】：该培养基用酚红指示剂，在酸性时呈黄色，碱性时呈红色。细菌如能发酵乳糖和葡萄糖而产酸产气，则斜面与底层均呈黄色，且有气泡。如只发酵葡萄糖不发酵乳糖，因葡萄糖含量少，斜面所生的少量酸可因接触空气而氧化挥发，从而使斜面部分保持原来的红色；底层由于是在相对缺氧状态下，细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化挥发而保持黄色。如细菌分解蛋白产生硫化氢，则与硫化亚铁作用生成黑色的硫化铁，使培养基变黑。6.克氏双糖铁（KIA）复合试验【方法】：将待检菌接种于克氏双糖铁培养基（底层穿刺，上层斜面划线），35ºC，24h，观察。【结果】：发酵乳糖和葡萄糖产酸产气，则上层和底层均呈黄色且有气泡产生；只发酵葡萄糖而不发酵乳糖，则底层变黄，上层仍为红色。如底层变黑，说明该菌产生硫化氢，生成黑色的硫化铁沉淀。双糖铁培养基标准管痢疾杆菌KA－－伤寒杆菌KA－＋大肠杆菌AA＋－7.动力、吲哚及脲酶（MIU）复合试验【原理】：培养基为含尿素、蛋白胨的半固体培养基，指示剂为酚红。具色氨酸酶的细菌能分解色氨酸产生吲哚，加入吲哚试剂后，培养基上层的吲哚会变红；具脲酶的细菌能分解尿素产氨，使整个培养基变碱呈红色；有动力的细菌沿穿刺线扩散生长。【方法】：将大肠埃希菌和普通变形杆菌穿刺线接种于MIU培养基，35ºC，18-24h，观察动力和脲酶反应后，再滴加吲哚试剂。【结果】：扩散生长为动力阳性；滴加吲哚试剂后呈玫瑰红色为阳性；培养基变红脲酶阳性。大肠埃希菌MIU（＋＋－）三、数字编码鉴定【原理】：数字编码鉴定技术，是计算并比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现频率总和。计算单项发生频率和多项发频率，得出鉴定百分率（%id），按鉴定百分率排序、查码。三、数字编码鉴定【具体内容】：是将鉴别细菌的各种生化反应微量化与综合系列化，将各种生化反应培养基分装在微量板或微量管内，组成系列试剂；操作时，把持检细菌纯培养物接种于每个微量孔或微量管内，经一定温度和时间培养后，再加入指示剂或直接根据顔色变化得出生化反应结果，将结果进行编码。号码编出后，输入电脑或通过编码本，找出与该号码相对应的细菌名称，便可作出初步鉴定。