蛋白质生物化学……考试题答案

7.022001年秋季Ver1.02版7.02Fall2001ProteinBiochemistryStudyGuideKey1蛋白质生物化学……考试题答案1．下面七种氨基酸，在每个氨基酸后面的横线上填上它对应的性质特征的字母。氨基酸性质甘氨酸（Gly）h，ba）pH＝7时带电荷苏氨酸（Thr）gb）非极性/疏水性脯氨酸（Pro）c，d（b）c）亚氨酸苯丙氨酸（Phe）b，d，ed）具有环状结构半胱氨酸（Cys）f，（b，g）e）在280nm处有吸收谷氨酸（Glu）a，（g）f）有硫原子赖氨酸（Lys）a，（g）g）极性/亲水性h）具有昀简单的侧链括号内的答案是正确但不是必需的。2．某天生化学家小Johnny用7.02节的方法纯化　－半乳糖苷酶，他遇到了下面一些问题，请解释为什么小Johnny的实验不能顺利进行，并帮他想想解决的办法。a）在DEAE柱子的穿过峰中有　－半乳糖苷酶。这个问题的正确答案不止一个，包括：上样量太大，缓冲液pH值不合适，在蛋白样品或柱床中的缓冲液中含盐量太高（硫铵沉淀后的样品没有脱盐）。b）聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样时，样品从孔中扩散到电泳缓冲液中。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。c）在一个新发现的蛋白Namedoesn’tmatter-ase的硫铵沉淀后，小Johnny重悬沉淀时，他检测发现没有活性，实验室的博士后用小Jhonny的试剂并用和他完全一样的方法重做硫铵沉淀这一步。这个博士后却得到了有活性的蛋白质，为什么？这是一个怪题，蛋白质可能还留在上清中而没有在下面的沉淀里，所以上清中才有酶的活性，小约翰并没有检测上清的酶活性，所以他发现没有活性！3．画出多肽asp－val－glu－gly的结构并圈出肽键。（参看附页）7.022001年秋季Ver1.02版7.02Fall2001ProteinBiochemistryStudyGuideKey24．判断下面的句子的对错，并用T表示正确，F表示错误。Ta）当酶的催化速度是昀大速度的一半时，Km＝[S]。Fb）在凝胶过滤中，小分子物质昀先流出来。Fc)胶原蛋白的重复单元是ala－pro－hyp。Td）抗体的重链包括一个可变区和3个恒定区。Te)镰刀型贫血症是由血红蛋白　链上第6位的Glu被Val代替引起。5．a）画一个包括两个　链（每个有　个氨基酸（用R1，R2，R3…..，R8表示这8个氨基酸的侧链））的反平行式　折叠片层结构。（参看附页）b）圈出你画的结构图中所有的氢键结构。（参看附页）c）片层的一侧有较强的疏水性，给出具有这种性质的三种氨基酸的全名：丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸。d）在你画的结构图中圈出保证片层一侧具有强疏水性的必需的疏水性R基团。（参看附页）6．简要说明SDS和　－巯基乙醇在蛋白质变性中的作用。　　SDS是兼性分子，由一个长的碳链和一个极性的、带电荷磺酸基团组成，它通过和蛋白质分子中的氨基酸发生疏水相互作用而使蛋白质变性，它还把蛋白质包裹起来使蛋白质表面带负电荷。　－巯基乙醇是强还原剂，可以断裂的二硫键(分子内和分子间)。7.022001年秋季Ver1.02版7.02Fall2001ProteinBiochemistryStudyGuideKey3蛋白质生物化学实验……测验试题的参考答案问题＃1（共20分）说明下列试剂在PBC实验中的用途，（完整的答案需要简明扼要表述清楚什么实验中使用，使用的目的和方法是什么）（每个4分）。a）溶菌酶·一种酶（不是洗涤剂也不是化学制品），·在PBC第一天的实验中中用来裂解细菌细胞，·断裂细胞壁中的交连（细胞膜扣0.5分）。b）APTG·在纯化β－半乳糖苷酶的实验中亲和柱层析时使用，·是β－半乳糖苷酶的底物类似物；β－半乳糖苷酶能和它特异性地结合，·不被降解。c）硝酸纤维素膜·在蛋白质印迹（Westernblotting）实验中使用，·和蛋白质非特异性结合，·电流把蛋白质从凝胶中转移到膜上。d）碳酸钠（Na2CO3）·终止β－半乳糖苷酶催化的反应，·强碱，提高pH值，通过使　－半乳糖苷酶去折叠/变性终止反应，·并且帮助ONP显色。e）DTT·（弱）还原剂（不是去污剂），·用于缓冲液/溶液中（柱层析用的缓冲液），·断裂非天然二硫键，促进蛋白质折叠，模拟细胞内环境（弱还原性）。问题＃2（共19分）a）（8分）画出pH7.0时下面这个四肽的结构图：7.022001年秋季Ver1.02版（N端）Cys－Tyr－Lys－Glu（C端）（参看附页）侧链（6分）－1.5分/AA；缺失或增加一个碳源子或R基团错误各扣0.5分，肽键（2分）－肽键必须在一个平面上）（侧链交替）。b）（1分）这个四肽的四个氨基酸中哪个能形成二硫键？半胱氨酸c）（6分）　螺旋的稳定是由于　氢供体　和　氢受体　之间的氢键的作用，在你在a）中绘制的结构图中用“D”（D）标明氢原子供体，用“A”（　）标明氢原子受体。（参看附页）侧链氢原子供体　分主链氢原子供体　分半胱氨酸被标扣0.5分d）（4分）下面是　螺旋横截面图解，氨基酸　的侧链标为　＃　　，在你所知道的　螺旋结构的基础上，标出氨基酸＃　－　的侧链位置，（假想你通过螺旋的纵轴往下看，　末端在靠近你的这一端）。顺时针：　1分正确的顺序：3分假如氨基酸的位置碰巧正确的话，每个0.5分问题＃3（共14分）a）（8分）在下列水平上简单定义蛋白质结构，并从实验或讲义中各选择一个例子：二级结构定义（3分）－不考虑侧链的主链的构象，例子（1分）－　螺旋（　片层或转角）。7.02Fall2001ProteinBiochemistryStudyGuideKey47.022001年秋季Ver1.02版7.02Fall2001ProteinBiochemistryStudyGuideKey5四级结构定义（3分）－亚基的空间排列（亚基＝一个多肽链），亚基之间以非共价键相互作用的方式相连，有时它们之间存在二硫键。例子（1分）－血红蛋白的　个亚基等等。b）（6分）给下列分子中主要的三级结构单元命名：胶原蛋白分子：超螺旋，无规卷曲（3个　螺环互相包装在一起）免疫球蛋白（如IgG）：扁平的　β－桶或　扁平的β－桶绿色荧光蛋白（GFP）　β－桶问题＃4（共12分）在7.02结束后，你决定在JeanTics博士的实验室做一个UROP，JeanTics博士想知道你对7.02中蛋白质纯化掌握的情况，所以她要你用实验室比较成熟的方法纯化PHD异构酶。从细胞初提液（CL）开始，你采用下面的方法（并对得到的样品进行检测）：1．硫铵沉淀（得到：“AS－P”）2．用PD－10层析柱脱盐（得到样品“DEAE－load”）3．DEAE柱层析（合并DEAE分部流出液得到样品“DEAEtotal”）4．PD－10脱盐后直接过亲和层析（得到样品“AFafterPD10”）然后你检测每个样品的PHD异构酶的活性，得到下面的结果：样品体积（ml）蛋白浓度（mg/ml）蛋白总量（mg）酶活力单位（U）比活提纯倍数CL25410020000020001×AS－p4104012000030001.5×DEAE－load217.53510500030001.5×DEAEtotal211226820031001.55×AFafterPD－10133600002000010×a)(5分)在上面的表格中填写比活力和纯化倍数（在需要的地方注明单位）。比活：单位＝U/mg(没有单位扣0.5分)；每个比活0.5分，提化倍数（没有单位）―每个0.5分7.022001年秋季Ver1.02版7.02Fall2001ProteinBiochemistryStudyGuideKey6b)（3分）在这个纯化流程中哪一步纯化效率昀高？为什么？亲和层析（或第四步）的纯化效率昀高（1分）。因为这一步有昀高的提纯倍数（2分）。c)（4分）如果Tics博士要你改进这个纯化工艺，你会去除哪一步？为什么？你可以通过去掉DEAE柱层析（第3步）改进纯化工艺（1分）。因为这一步没有提高比活或提纯倍数，反而损失了大量蛋白（3分）。考虑到你在蛋白纯化方面掌握的已经很好，Tics博士又给你了新得难题：纯化并鉴定酶“NoPBCase”的野生型和突变体。准备好细胞初提液（CL）后，你决定先通过硫铵沉淀纯化“NoPBCase”。问题#5（共25分）相信你在蛋白质纯化方面是一个行家，Dr.Tics提出了一个挑战：纯化并辨别“NOPBCase”酶的野生型与突变型。在你得到粗提液后（CL），你决定用硫酸铵沉淀“NOPBCase”。a）（4分）简单描述硫酸铵怎么沉淀蛋白质。在溶液中，蛋白质被溶剂包裹（水和蛋白质表面电荷之间存在氢键和离子相互作用力），增加溶液中的盐离子浓度会干扰/破坏这种（水和硫酸铵的作用取代了和蛋白质的作用）（2分）。这样蛋白质分子间就会发生相互作用，逐渐聚集并从溶液中沉淀出来（2分）。如果写成“盐析”（给1分），对这个过程描述不完整的酌情给分。和你一起工作的博士后已经对NoPBCase做了一些原始的工作，她发现在40％的硫铵中这个酶会完全沉淀。不幸的是，在计算应该加入多少AS时你因为犯了个错误，配成了60％的硫铵溶液！b)(3分)你估计这个错误会对硫铵沉淀后得到的样品AS－P的总活力（T.A.）产生什么影响，升高，降低，还是不变？为什么？（答案1分，推理2分）我的答案是：如果在40％的硫铵中NoPBCase完全沉淀，那么我们预计在60％的硫铵溶液中不会有更多的酶沉淀，既然总活力反映的是目的酶的活力，我们预计AS－P的总活力（T.A.）不会发生变化。如果有人认为因为变性蛋白质，TA会降低（假定高盐会降低酶活力），也应得到满分。c）（3分）这个错误会怎样影响AS－P的比活（S.A.）（升高，降低，还是不变）？并给出理由。（答案1分，推理2分）比活＝总活力/蛋白总量。总活力应该不会因为硫酸铵增加到60％而变化，但是由于硫酸铵增加到60％，预计会有更多的蛋白质从溶液中沉淀出来。因此蛋白量会增多，比活（“纯度”）会降低。如果你认为因为酶的变性，总活性降低，在这里你也必须提到蛋白量的增多才能得到满分。7.022001年秋季Ver1.02版在下一步，你决定采用离子交换层析，由于你几乎不知道关于NoPBCase的任何性质，你决定阴离子交换层析（DEAE－Sephacel）和阳离子交换层析（CM－纤维素）都试一试。每种介质各上一半的AS－P，并收集穿过峰（FT），然后增大洗脱液离子浓度，使柱子上的蛋白质全部被洗脱下来，并分步收集记为1－5，昀后，检测收集的每个样品的活性（NoPBCase可催化产生有颜色的物质的反应，该产物可以通过检测在420nm下的吸收进行定量）。d）（7分）在下面不同的样品对应的吸收图中，如果NoPBCase在缓冲液条件中带正电荷，标出NoPBCase的活性应该出现的昀高点。简单说明你的理由。（每图1.5分，推理4分）DEAESephacel和其他的阴离子交换介质一样，会结合带负电荷的蛋白质，这样，在DEAESephacel层析中，带正电荷的NoPBCase会出现在穿过峰中;CM－纤维素是阳离子交换介质，结合带正电荷的蛋白质，如NoPBCase，它很可能会在中等的盐浓度梯度被洗脱下来(至于在什么盐浓度条件下被洗脱下来，这取决于它表面所带的净电荷)，因洗脱液中的阳离子能竞争性结合介质上的阴离子而把NoPBCase替换下来时，NoPBCase就被洗脱下来。如果你混淆了阴阳离子交换剂，但是你的推理比较正确的话将得到2分。昀后你决定鉴定NoPBCase的大小和结构，你发现在凝胶过滤中NoPBCase的分子量可能在120KDa（因为其在120KDa标准蛋白的流出位置处流出），接下来你和你的博士后同伴决定用你纯化的样品做蛋白质印迹实验（Westernblots）。你们都先跑SDS－PAGE电泳，然后一起用NoPBCase抗体做Westernblots，你们的结果如下：7.02Fall2001ProteinBiochemistryStudyGu