食品中各类微生物检验2

第二章食品中各类微生物检验第一节食品中菌落总数的测定第二节食品中大肠菌群的测定第三节食品中金黄色葡萄球菌的检验第四节食品中沙门氏菌的检验第五节食品中志贺氏菌的检验第六节食品中溶血性链球菌的检验第七节食品中病原性大肠艾希氏菌的检验第八节食品中变形杆菌的检验第九节食品中空肠弯曲菌的检验第十节食品中致病性弧菌检验第十一节食品中耶尔森氏菌的检验第十三节食品中肉毒梭菌的检验第十四节食品中蜡样芽胞杆菌的检验第十五节食品中产气荚膜梭菌的检验第十六节食品中霉菌和酵母菌的检验第一节食品中菌落总数的测定食品中细菌数量越多，则食品腐败变质的速度就越快，甚至可引起食用者的不良反应。如有人认为细菌数量达到100~1000万个／g时，食品就可能引起食用者的食物中毒。食品中细菌数量越少，食品存放的时间越长。如：0℃时菌落数为105cfu/cm2的牛肉，可存放7d；菌落数为102cfu/cm2时，可存放18d。0℃时菌落数为105cfu/cm2的鱼可存放6d，菌落数为103cfu/cm2时，可存放12d。菌落(colony)：生长在固体培养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。菌落总数(totalcolonynumber)：通过平板菌落计数的方法，对被检样品单位重量、容积、面积的活菌在普通营养琼脂平板上形成的菌落进行计数，所得到的所有嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数。是活的细胞总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数.所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此,菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。检验方法基本操作一般包括:样品的稀释－－倾注平皿－－培养48小时－－计数报告。以无菌操作取检样25g（或25mL)，放于225mL灭菌生理盐水玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠)制成1：10的均匀稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成1：100的稀释液另取1mL灭菌吸管，按上项操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL灭菌吸管。倾注培养根据标准要求或对污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度，分别在制10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。计数和报告选取菌落数在30~300之间的平板作为菌落总数测定标准。我国饮用水卫生标准：≤100个细菌总数/1mL饮水第二节食品中大肠菌群的测定一、大肠菌群与食品卫生质量大肠菌群系指一群在37℃能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。从种类上讲，大肠菌群包括许多生化及血清学特性均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属，枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等。以埃希氏菌属为主。大肠菌群MPN是指在100mL(或100g)食品检样中所含的大肠菌群的最近似或最可能数。大肠杆菌(埃希氏菌属Escherichine)是人类和动物肠道中的正常菌群出生后数小时就进入肠道，并终生伴随以大肠埃希氏菌（E.coli）最为重要在环境和食品卫生学上，常被用作粪便污染的检测指标；作为肠道病原菌污染食品的指示菌。当然食品中检验出大肠菌群，只能说明有肠道病原菌存在的可能，两者并非一定平行存在。但只要食品中检出大肠菌群，则说明有粪便污染。该食品仍可被认为是不卫生的。卫生学指标在分子生物学和基因工程实验中重要的实验材料和研究对象大肠杆菌也是重要的实验材料和研究对象正常菌群，一般不致病1、条件致病某些带有致病基因的血清型，引起肠道感染两大原因可以致病细菌居住部位改变引起的肠外感染；尿路感染最常见2、致病菌株日本再度发生O157病菌感染事件--------------------------------------------------------新华网东京４月６日专电日本最近再度发生病原性大肠杆菌Ｏ１５７集体感染事件，到５日为止，东京、千叶、埼玉、神奈川、茨木、群马等地已有１２５人受到感染。这次集体感染于３月１２日首先在千叶县柏市被发现。诊断和调查结果表明，患者是由于食用了一些工厂生产的不洁净的食品而被感染的。日本曾于５、６年前首次发生病原性大肠杆菌Ｏ１５７集体感染事件。患者有发烧、恶心、呕吐等症状。2001年4月9日17:29新华网报道2001年，江苏、安徽等地，肠出血性大肠杆菌O157:H7，造成177人死亡，中毒人数超过2万人。大肠菌群MPN的常规检验方法是将不同倍数的检样稀释液接种到乳糖胆盐发酵管内，经一定的温度、时间发酵，若均不产气者则可报告为阴性；如有产气者，则需进行分离培养，证实试验，然后查取MPN检索表，报告出每100mL(g)大肠菌群的最近似数。大肠菌群MPN的检验程序如下：检样稀释：(1)以无菌操作将检样25mL(或25g)放于含有225mL灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用匀质器。以8000-10000转／分钟的速度处理1分钟，做成1：10的均匀稀释液。(2)用1mL灭菌吸管吸取1：10稀轻液1mL．注入含有9mL灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀．作1：10的稀释液。操作步骤(3)另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌吸管：(4)根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。操作步骤检验方法(一)乳糖发酵试验在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。操作步骤将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种3管，置36+1℃温箱内，培养24+2小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，按下列程序进行。操作步骤(二)分离培养将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板上，置36±1℃温箱内培养18—24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。操作步骤证实试验在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1—2个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24+2小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。操作步骤报告根据证实为大肠群阳性的管数，查MPN的检索表(见附录一)，报告每100mL(g)大肠菌群的最近似数(MPN)。大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂的主要作用是抑制其它杂菌，特别是革兰氏阳性菌的生长。国家标准中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，行业标准中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。抑菌剂虽可抑制样品中的一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌的生长和挑选，但对大肠菌群中的某些菌株有时也产生一些抑制作用。大肠菌群MPN的其它检验方法大肠菌群MPN的其他测定方法有琉水网膜法、TTC（2、3、5、—氯化三苯四氮唑）显色法，DC(去氧胆酸钠)半固体法、纸片法等。我国饮用水卫生标准：≤3个大肠菌群/1L饮水北美国家一般使用“粪大肠菌群”概念，如AOAC、FDA。SN中的“粪大肠菌群”概念为等同采用AOAC方法，故而使用粪大肠菌群概念；而欧洲使用“耐热大肠菌群”概念，较少使用“粪大肠菌群”。项目依据耐热大肠菌群NMKL、ISO粪大肠菌群NMKLAOAC定义在44.5℃培养，24h内能产酸产气的细菌在胰蛋白胨肉汤中于44.5℃，24h内产生吲哚的耐热大肠菌群于LST中36℃培养48h内产气，并于EC内培养44℃24h产气的一群细菌第三节食品中金黄色葡萄球菌的检验金黄色葡萄球菌急性化脓性感染食物中毒正常人带菌，30-80%通过工人手和呼吸道污染食品金黄色葡萄球菌在生牛奶、熟肉制品及冰激凌等3类食品中的检出率为19.67%；前两种食品的污染率分别为25.13%和20.33%。浙江CDC2000-2004年监控结果金葡感染染色观察在BP平板上的典型菌落大阪市政府５日宣布的调查结果显示，因食用日本雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒者已逾万人。在大阪府和京都府以及附近６县，因食用雪印乳业公司大阪工厂生产的乳制品而中毒发病者已达１０６８２人，其中有１５５人被送往医院，目前还有３７人在医院接受治疗。据化验，该工厂生产的一些乳制品中含有黄色葡萄球菌，这种细菌可产生使人出现腹泻、呕吐症状的Ａ型肠毒素。该厂乳制品染菌是生产设备没有按规定定期清洗而造成的。媒体关于日本雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件的报道日本因食用染菌乳制品中毒者已逾万人(2000年7月6日12:39)检验方法样品处理：无菌取25g或25mL食品样品，放入225mL灭菌生理盐水中均质，制成1：10稀释液。增菌培养：将1：10稀释液接入7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中，37°C培养24小时。分离培养：将上述稀释液或培养液分别划线血平板和Baird-Parker平板，置37°C培养24-48小时。金黄色葡萄球菌在血平板上呈金黄或白色菌落，大而凸起，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird-Parker平板上菌落为圆形，直径2-3mm，颜色灰或黑色，周围有一浑浊带。染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性，显微镜下呈葡萄状排列无芽胞、荚膜，直径0.5-1μm。血浆凝固酶试验：吸取0.5mL兔血浆与0.5mL金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤24小时培养物充分混匀，置36±1°C培养，每隔半小时观察一次，连续观察6小时，出现凝固，即将小试管倾斜或倒置时，内容物不流动，判为阳性。同时做阴阳性对照。耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min，用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板，36±1°C培养24小时，在刺种线周围出现淡粉色者为阳性。第四节食品中沙门氏菌的检验其中许多为人畜共患病一大群人与动物肠道中的寄生菌菌群菌型甚多，仅少数对人致病沙门氏菌广泛存在于动物肠道、内脏中。引起中毒的主要是动物源性食品。本菌对热、消毒药及外界环境的的抵抗力不强。60℃，20-30min即被杀死。1、致病物质：致病性与免疫性侵袭力：O抗原、VI抗原毒素：内毒素2、所致疾病：伤寒副伤寒食物中毒（急性胃肠炎，表现为头痛、恶心、面色苍白、出冷汗、随之出现呕吐腹泻、体温升高，并伴有水样便，有时带脓血粘液，重者出现寒战、抽搐和昏迷等病程3~7d，死亡率0.5%。）败血症外毒素----肠毒素伤寒未接受过治疗的病人致死率可超过10%，而对经过适当治疗的病人其致死率低于1%，幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。这些无症状携带者不显示发病症状仍能将微生物传染给其他人(传统的例子就是玛丽伤寒)。非伤寒型沙门氏菌败血症可由各型沙门氏菌感染所致，能影响所有器官，有时还引起死亡。幸存者可变成慢性无症状沙门氏菌携带者。胆囊-----肠道-------粪排菌皮肤----血拴出血--