食品微生物检验技术-广西职业技术学院3

一、培养基中的主要成分及其作用（一）、营养物质N源、C源、无机盐、生长因子、水第一节培养基1、常用的N源物质蛋白胨牛肉膏肉浸汁酵母膏（1）蛋白胨有：普通蛋白胨示胨胰蛋白胨（2）、牛肉浸液成份：含氮物：肌酸、嘌吟、核苷酸尿酸肌肽等糖类物质：葡萄酒3肝糖、P-已糖生长因子：硫胺、核黄素、泛酸、叶酸等8种B族维生素（3）、组织浸液组织浸液，主要为微生物生长繁殖提供可溶性含氮物质、核酸降解物、维生素及无机盐等，补充蛋白胨营养成分的不足部分。包括动物组织浸液、植物组织浸液、微生物细胞浸液。2、糖、醇类物质单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖多糖：淀粉、纤维素、菊糖醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油（二）、水用蒸馏水，不能用自来水（三）、凝固剂琼脂、明胶、血清等要求：清一色、杂质少（四）、抑制剂1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素（五）、指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等二、培养基的类型在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基(Media)。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。（一）、根据培养基的物理状态来区分固体培养基液体培养基半固体培养基1、液体培养基主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等3、半固体培养基观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。（二）、根据培养基的用途来区分增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。增菌、运送用培养基B2胆盐乳糖培养基（BL）大肠杆菌增菌B3亚硒酸盐增菌培养基沙门氏菌增菌B4亚硒酸盐半胱氨酸增菌培养基食品中沙门氏菌增菌B5四硫磺酸钠亮绿基础培养基沙门氏菌增菌B6GN肉汤培养基志贺氏菌增菌B7碱性蛋白胨水培养基霍乱弧菌增菌B87.5%氯化钠肉汤培养基金黄色葡萄球菌增菌B9缓冲蛋白胨水培养基沙门氏菌增菌B10血液增菌培养基血液中细菌增菌B11SCDLP液体基础培养基化妆品中细菌增菌2、选择培养基在培养基中加入某种物质以杀死或抑制不需要的菌种生长的培养基，称之为选择培养基。分离培养用的培养基名称用途SS琼脂培养基沙门氏和志贺氏菌属分离HE琼脂培养基志贺氏菌分离鉴别伊红美蓝琼脂培养基大肠杆菌、产气杆菌分离鉴别麦康凯琼脂培养基（MacC）肠道致病菌分离甘露醇高盐琼脂培养基）绿脓杆菌分离鉴别XLD琼脂培养基志贺氏、沙门氏菌分离中国蓝琼脂培养基肠道菌分离鉴别碱性琼脂培养基霍乱弧菌分离高盐蔡氏琼脂培养基真菌、酵母菌分离3、鉴别培养基在培养基中加入某种试剂或化学药品，使难以区分的微生物经培养后呈现出明显差别，因而有助开快速鉴别某种微生物。这样的培养基称之为鉴别培养基。鉴别用培养基名称用途蛋白胨水培养基靛基质和霍乱红试验乳糖胆盐发酵培养基大肠杆菌发酵乳糖试验0.5%乳糖发酵培养基肠道菌生化试验（复发酵）半固体培养基动力试验和菌种保存三糖铁琼脂培养基（TST）肠杆菌糖发酵及硫化氢反应氰化钾基础培养基沙门氏菌分离脱羧酶试验对照培养基细菌脱羧酶试验（三）培养基制备的基本方法和注意事项培养基的制备记录培养基成分的称取培养基各成份的混合和溶化培养基pH的初步调正培养基的过滤澄清培养基的分装培养基的灭菌培养基的质量测试培养基的保存1、培养基的制备记录每次制备培养基均应有记录，包括培养基名称，配方及其来源，和各种成份的牌号，最终pH值、消毒的温度和时间制备的日期和制备者等。记录应复制一份，原记录保存备查，复制记录随制好的培养基一同存放、以防发生混乱。2、培养基成分的称取培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱，最好一次完成，不要中断。可将配方置于傍侧，每称完一种成分即在配方上面做出记号，并将所需称取的药品一次取齐，置于左侧，每种称取完毕后，即移放于右侧。完全称取完毕后，还应进行一次检查。3、培养基各成份的混合和溶化指示剂应在调节好PH值后再加入；煮溶后要补加足水份；不能把培养基煮焦，焦化的不能使用。4、培养基pH的校正灭菌后PH值会下降0.1～0.2，在做培养基校正PH值时，应比实际值高0.1～0.2；PH调整后，还应将培养基煮沸。5、培养基的过滤澄清液体培养基可用滤纸过滤法琼脂培养基,可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤６、培养基的分装斜面：1/５管半固体培养基：1/3管高层斜面：1/4～1/3管平板：13~15ml7、培养基的灭菌（1）含糖类或明胶的培养基：113℃灭菌15分钟或115℃灭菌10分钟。（2）无糖培养基：121℃灭菌15~20分钟。（3）血液、体液和抗生素等以无菌操作技术抽取后再加入冷却至约50℃左右的培养基中。（4）琼脂斜面培养基应在灭菌后冷至55℃-60℃时取出，再摆置成适当斜面。8、培养基的质量测试（１）如发现破裂、水分浸入、色泽异常、棉塞被培养基沾染等、均应挑出弃去。并测定其最终pH。（２）将全部培养基放入36±1°C恒温箱培养过夜，如发现有菌生长，即弃去。（３）用有关的标准菌株接种1~2管或瓶培养基，培养24～48小时，如无菌生长或生长不好。应追查原因并重复接种一次，如结果仍同前，则该批培养基即应弃去，不能使用。9、培养基的保存（1）基础培养基不能超过两周（2）生化试验培养基不宜超过一周，（3）选择性或鉴别性培养最好当天使用，倾注的平板培养基不宜超过3天。思考题1、加入培养基中的抑制剂有什么作用，常用的抑制剂有哪些？2、在制备培养基时，将各成份溶化时要注意哪些问题？3、在制备培养基时，如何进行培养基pH的初步调正？4、如何选择培养基的灭菌条件？5、如何进行培养基的保存？培养基配制–器材培养基、玻璃器皿天平秤、药匙培養基配製–儀器杀菌锅(Autoclave)无菌操作台(Laminarflow)培养基的配制–装水1.以量桶裝取適當量蒸馏水於玻璃容器中2.於玻璃容器上标示培养基名称培養基配製–秤藥1.放上秤藥紙並歸零2.以秤藥匙舀出適當量培養基(請看培養基罐上說明)培養基配製–溶解培養基傾倒培養基時小心不要沾到玻璃壁上注意事項–配藥結束1.清理配藥桌面與天平2.清洗秤藥匙，擦乾放回3.藥品放回藥品櫃培養基配製–分裝1.調整分注器(Dispensette)刻度2.分裝試管3.蓋上試管蓋放入杀菌锅(Autoclave)灭菌培養基配製–灭菌加水蓋過鐵板放東西關門調整溫度時間關緊洩壓閥注意事項–杀菌锅的使用注意事項–殺菌釜使用滅菌結束後，等壓力降回零時才可打開門進入殺菌釜之物品，蓋子不可關太緊或太鬆注意事項–殺菌釜使用拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培養基配製–平板培養基滅過菌之固態培養基於無菌操作台(Laminarflow)內倒製平板培養基(Plate)日光燈UV燈風扇第二节、微生物检验的基本操作技术主要内容无菌技术M的接种与分离技术微生物的培养方法微生物的生长现象与观察一、无菌技术（一）什么是无菌技术指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。（二）无菌环境无菌室无菌柜超净工作台1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间（2）无菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）.每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）.每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。2、超净工作台超净台的使用与保养:（1）风速保持在0.32-0.48米/秒;（2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上;（3）让超净台预工作10－15分钟;（4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干净.（三）无菌器材灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等.消毒器材：无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台、手等（四）无菌操作1、目的：（1）是保证待检物品不被环境中微生物的污染；（2）是防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。2、进入无菌室前的准备（1）、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；（2）、用紫外线灭菌处理30~60分钟；（3）、检查无菌器材是否完备；（4）、洗手消毒；（5）、手部消毒后，再穿戴无菌工作服。3、检验操作过程的无菌操作要求（1）、在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）、使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）、在正火焰上方操作；（4）、接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）、在接种培养物时，协作应轻、准。（6）、不能用嘴直接吸吹吸管。（7）、带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。无菌操作斜面接种时的无菌操作(1)接种灭菌(2)开启棉塞(3)管口灭菌(4)挑起菌苔(5)接种(6)塞好棉塞1.接種環前端鐵絲部分以酒精燈烧红来菌，後端鐵棒部分過火无菌操作–取菌技巧12.試管前端過火3.打開試管蓋无菌操作–取菌技巧14.試管傾斜，放入接種環無菌操作–取菌技巧15.試管前端過火，蓋上試管蓋6.接種環燒紅滅菌无菌操作–取菌技巧15.試管前端過火，蓋上試管蓋6.接種環燒紅滅菌无菌操作–取菌技巧12.自Plate上取單一菌落(方法一：蓋子微開遮住培養基，避免空氣中菌體掉入)(方法二：plate反面拿起)无菌操作–取菌技巧21.擠出安全吸球內空氣，插上滅過菌之玻璃吸管2.向上為吸，向下為放无菌操作–取菌技巧31.調整Pipetman刻度(P1000吸取範圍200~1000μl)2.插上滅過菌之Tip(用力插緊)无菌操作–取菌技巧43.按鈕壓至第一段(不可壓至最底)4.深入液面下2~4mm无菌操作–取菌技巧45.慢慢釋放按鈕，即可吸取液體无菌操作–取菌技巧41.試管前端過火2.打開試管蓋无菌操作–接菌技巧方法一：以接種環沾菌，放入新的培養基中接菌方法三：以Pipetman吸取菌液，按鈕壓至最底排出菌液方法二：以安全吸球吸取菌液，放入新的培養基中，向下排出菌液无菌操作–接菌技巧操作時離火源遙遠試管直放，空氣中菌體容易掉入無菌操作–錯誤示範無菌操作–錯誤示範安全吸球倒放，菌液容易流入吸球內安全吸球隨意放置桌面，菌液容易流出至桌上無菌操作–錯誤示範Pipetman倒放，菌液容易流入Pipetman內注意事項–生物性廢棄物生物性廢棄物放至正確位置以便滅菌二、微生物的接种与分离技术（一）、接种将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。１、接种工具和方法接种和分离工具1．接种针2.接种环3.接种钩4.5.玻璃涂棒6.接种圈7.接种锄8.小解剖刀常用的接种方法有以下几种：１）划线接种２）三点接种３）穿刺接种４）浇混接种５）涂布接种６）液体接种７）注射接种８）活体接种(二)、分离纯化１、倾注平板法２、涂布平板法倾注平板法（a）涂布平板法（b）图解1.菌悬液2.熔化的培养基3.培养物4.无菌水３、平板划线法平板划线分离法1.斜线法2.曲线法3.方格法4.放射法5.四格法平板划线法：1、倒平板，标记培养基名称，编号和实验日期。2、划线方法稀释混合平板法：1、先加菌2、倒平板时注意培养基温度3、混合均匀三、微生物的培养方法一般培养法（需氧培养）厌氧培养法CO2培养法（一）、一般培养法（需氧培养）培养温度:25~37℃（二）、厌氧培养方法1、简易的厌氧培养法：（1）庖肉培养法（2）铁丝圈厌氧培养法（3）焦性没食子酸法2、厌氧罐法3、厌氧手套箱法A、厌氧缸法厌氧缸是普通的干燥缸，用物理化学的方法使缸内造成厌氧环境，从而将厌氧菌培养出来。接种好标本的平板或液体培养基试管，可放入厌