中国黑色素瘤患者-BRAF基因突变分析

·论　　著·中国黑色素瘤患者ＢＲＡＦ基因突变分析１　１００１４２　北京肿瘤医院恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室２　通讯作者，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]１００１４２　北京　北京大学临床肿瘤学院北京肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所肾癌黑色素瘤内科朱琰琰１，斯　璐１，迟志宏１，崔传亮１，盛锡楠１，李思明１，韩　梅１，郭　军１，２　　【摘　要】　目的：探讨ＢＲＡＦ基因在中国人黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤中的突变率和类型。方法：用ＰＣＲ扩增和直接测序方法检测９０例中国恶性黑色素瘤（ＭＭ）患者肿瘤组织中ＢＲＡＦ外显子１１和１５的突变情况。结果：黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤患者肿瘤组织中ＢＲＡＦ基因的突变率分别为２３３％（７／３０）、１６７％（５／３０）和４３３％（１３／３０）；２５例ＢＲＡＦ基因突变中，１例为串联突变，其它均为点突变；仅有１例ＢＲＡＦ基因突变位于第１１外显子，其余２４例均位于ＢＲＡＦ第１５外显子。Ｖ６００Ｅ突变占所有ＢＲＡＦ基因第１５外显子突变的８３３％（２０／２４）。结论：ＢＲＡＦ基因在中国人非肢端皮肤黑色素瘤中突变率较高，且以该基因第１５外显子Ｖ６００Ｅ点突变为主，有可能成为靶向药物作用的靶点。　　【关键词】　ＢＲＡＦ；　基因突变；　黑色素瘤中图分类号：Ｒ７３９５　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９－０４６０（２００９）０７－０５８５－０４ＢＲＡＦｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｍｅｌａｎｏｍａｐａｔｉｅｎｔｓ　　ＺＨＵＹａｎｙａｎ，ＳＩＬｕ，ＣＨＩＺｈｉｈｏｎｇ，ＣＵＩＣｈｕａｎｌｉａｎｇ，ＳＨＥＮＧＸｉｎａｎ，ＬＩＳｉｍｉｎｇ，ＨＡＮＭｅｉ，ＧＵＯＪｕｎ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＲｅｎａｌＣａｎｃｅｒａｎｄＭｅｌａｎｏｍａ，ＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｓｃｈｏｏｌｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ＆Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００１４２，Ｃｈｉｎａ　　Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＧＵＯＪｕｎ，Ｅｍａｉｌ：[e-mail]　　【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｈｉｓｓｔｕｄｙｉｓｄｅｓｉｇｎｅｄｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｓｔａｔｕｓｏｆＢＲＡＦｉｎＣｈｉｎｅｓｅｍｕｃｏｓａ，ａｃｒａｌａｎｄｎｏｎａｃｒａｌｓｋｉｎｍａｌｉｇｎａｎｔｍｅｌａｎｏｍａ（ＭＭ）ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｅｘｏｎ１１ａｎｄ１５ｏｆＢＲＡＦｗｅｒｅａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｏｆ９０ｃａｓｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭＭｐａｔｉｅｎｔｓｂｙＰＣＲ；ｄｉｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｂｏｔｈｅｘｏｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＢＲＡＦｍｕｔａｔｉｏｎｒａｔｅｉｎｍｕｃｏｓａ，ａｃｒａｌａｎｄｎｏｎａｃｒａｌｓｋｉｎＭＭｔｉｓｓｕｅｓｗａｓ２３３％（７／３０），１６７％（５／３０）ａｎｄ４３３％（１３／３０）．Ｏｎｅｃａｓｅｉｎ２５ｗａｓｔａｎｄｅｍｍｕｔａｔｉｏｎａｎｄ２４ｗｅｒｅｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｏｎｅｍｕｔａｔｉｏｎｌｉｅｄｉｎｅｘｏｎ１１ａｎｄ２４ｌｉｅｄｉｎｅｘｏｎ１５，ａｎｄＶ６００Ｅｃｏｍｐｒｉｓｅｓ８３３％ｏｆａｌｌｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎｅｘｏｎ１５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＢＲＡＦｍｕｔａｔｉｏｎｉｓｆｒｅｑｕｅｎｔｉｎｎｏｎａｃｒａｌＭＭｏｆＣｈｉｎｅｓｅｐａｔｉｅｎｔｓ，ａｎｄｍｏｓｔｉｎｅｘｏｎ１５ｗｉｔｈＶ６００Ｅｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｒｅｎｄｅｒｓｉｔａｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｒｕｇｔａｒｇｅｔｔｏｂｅｓｔｕｄｉｅｄ．　　【ＫｅｙＷｏｒｄｓ】　ＢＲＡＦ；　Ｇｅｎｅｍｕｔａｔｉｏｎ；　Ｍｅｌａｎｏｍａ　　肿瘤的形成是一个多基因突变累积的过程，肿瘤基因突变检测的研究是生命科学研究领域的热点。国外学者对黑色素瘤患者肿瘤细胞的基因突变情况做了大量的研究，结果显示黑色素瘤细胞基因突变主要集中在ＭＡＰＫ途径［１］，其中ＢＲＡＦ基因突变在黑色素瘤中的发生率显著高于其他相关通路蛋白编码基因，在一些研究中其突变率高于６０％［２］。ＢＲＡＦ蛋白由３个保守结构域（ＣＲ）组成。ＣＲ１包含２个Ｒａｓ结合位点Ｒａｓ结合结构域（ＲＢＤ）和半胱氨酸富集结构域（ＣＲＤ）；ＣＲ２富含丝／苏氨酸残基；ＣＲ３为激酶结构域，是行使功能的主要部分。位于激酶结构域的Ｔ５９８和Ｓ６０１两个位点的磷酸化对于ＢＲＡＦ蛋白的激活至关重要［３］。ＢＲＡＦ基因突变导致编码氨基酸的改变，可以通过模拟重要位点的磷酸化从而造成ＢＲＡＦ激酶的持续性活化，激活下游的信号传导通路，导致细胞无限制地生长［４］。因而，针对ＢＲＡＦ及其下游激酶的小分子靶向药物，近年来在抗肿瘤药物研发中倍受关注。已有的国外·５８５·　临床肿瘤学杂志２００９年７月第１４卷第７期　ＣｈｉｎｅｓｅＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ．２００９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７　研究只包含了极少的亚洲人数据，但仍提示我们亚洲黑色素瘤从基因水平方面就与欧美白种人有很大的区别。而关于中国人黑色素瘤ＢＲＡＦ基因突变情况目前尚无相关的报道。因而，我们收集了我院９０例黑色素瘤患者的组织标本，进行了中国人黑色素瘤ＢＲＡＦ基因突变情况的研究，以期发现其与西方白种人所存在的差异。１　资料与方法１１　研究对象　收集北京肿瘤医院肾癌黑色素瘤内科２００６～２００８年住院和门诊患者的病灶组织蜡块９０例，均经ＨＥ染色和病理诊断证实。９０例患者分别为黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤各３０例。１２　肿瘤基因组ＤＮＡ提取和ＰＣＲ扩增目的基因　参照文献［５］手动分离石蜡包埋组织中的肿瘤细胞，基因组ＤＮＡ提取按照试剂盒说明书进行（ＱＩＡａｍｐＤＮＡＦＦＰＥＴｉｓｓｕｅＫｉｔ）。采用巢式ＰＣＲ扩增ＢＲＡＦ基因外显子１１和１５。引物序列如下：外显子１１：外侧上游引物，５’ＣＡＧＧＴＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴ３’，外侧下游引物，５’ＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣ３’；内侧上游引物，５’ＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＣＴＣＴＣＣＡ３’，内侧下游引物，５’ＧＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣＡＣＴ３’。外显子１５：外侧上游引物与内侧上游引物相同，５’ＴＴＡＴＴＧＡＣＴＣＴＡＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＧＡＡＧ３’，外侧下游引物，５’ＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＡＣＴＧＧＧＡＡＣ３’，内侧下游引物，５’ＧＧＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＧＡ３’。由于黑色素的存在会抑制ＤＮＡ的扩增，故依据文献［５］在反应体系中加入小牛血清蛋白（ＢＳＡ）减少这种抑制效应，ＢＳＡ的加入量为１５μｇ／２５μｋ。ＰＢＳ代替模板为阴性对照。反应条件为：初始变性９５℃５ｍｉｎ；９５℃６０ｓ，５７℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３２个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ。５μｌＰＣＲ产物用于凝胶电泳鉴定扩增产量和特异性（２％的琼脂糖凝胶电泳）。１３　ＤＮＡ测序　２０μｌＰＣＲ产物送北京华大基因纯化并测序，其中ＢＲＡＦ第１１外显子用内侧下游引物测序，第１５外显子用内侧上游引物测序。应用Ｃｈｒｏｍａｓ软件分析测序结果。２　结　果２１　目的基因凝胶电泳鉴定图２１１　ＢＲＡＦ外显子１１凝胶电泳图　８个泳道从左至右依次为：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ、阴性对照、６个不同样本ＢＲＡＦ外显子１１的ＰＣＲ产物。其中ＢＲＡＦ外显子１１的ＰＣＲ产物长度为３０４ｂｐ。见图１。Ｍ：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１：阴性对照；２～７：外显子１１标本图１　ＢＲＡＦ外显子１１凝胶电泳鉴定图２１２　ＢＲＡＦ外显子１５凝胶电泳图　８个泳道从左至右依次为：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ、阴性对照、６个不同样本ＢＲＡＦ外显子１５的ＰＣＲ产物。其中ＢＲＡＦ外显子１５的ＰＣＲ产物长度为３１４ｂｐ。见图２。Ｍ：１００ｂｐＤＮＡｌａｄｄｅｒ；１：阴性对照；２～７：外显子１５标本图２　ＢＲＡＦ外显子１５凝胶电泳鉴定图２２　ＢＲＡＦ基因在黏膜、肢端和非肢端皮肤恶性黑色素瘤中的突变率　９０例黑色素瘤组织中共检测出ＢＲＡＦ基因突变２５例，黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤组织中突变率分别为２３３％（７／３０）、１６７％（５／３０）和４３３％（１３／３０）。２３　ＢＲＡＦ基因突变类型和分布区域　２５例ＢＲＡＦ基因突变中，１例为串联突变，其它均为点突变；１例突变位于ＢＲＡＦ基因第１１外显子，即Ｇ４６６Ｒ（Ｇ１３９６Ａ）突变，其余２４例均位于ＢＲＡＦ基因第１５外显子，其中Ｖ６００Ｅ（Ｔ１７９９Ａ）突变２０例，其它４例突变分别为Ｓ６１６Ｆ（Ｃ１８４７Ｔ）、Ｋ６０１Ｅ（Ａ１８０１Ｇ）、Ｄ５９４Ｇ（Ａ１７８１Ｇ）及串联突变Ｖ６００Ｋ（Ｇ１７９８Ａ、Ｔ１７９９Ａ）。ＢＲＡＦ基因第１５外显子突变比例占所有ＢＲＡＦ突变的９６０％，并且Ｖ６００Ｅ突变占所有ＢＲＡＦ第１５外显子突变的８３３％（２０／２４）。·６８５·　临床肿瘤学杂志２００９年７月第１４卷第７期　ＣｈｉｎｅｓｅＣｌｉｎｉｃａｌＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｊｕｌ．２００９，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．７　２４　ＢＲＡＦ突变测序图　研究中检测到６种突变类型的测序结果，包括点突变Ｇ４６６Ｒ（Ｇ１３９６Ａ）、Ｖ６００Ｅ（Ｔ１７９９Ａ）、Ｓ６１６Ｆ（Ｃ１８４７Ｔ）、Ｋ６０１Ｅ（Ａ１８０１Ｇ）、Ｄ５９４Ｇ（Ａ１７８１Ｇ）和串联突变Ｖ６００Ｋ（Ｇ１７９８Ａ、Ｔ１７９９Ａ）。测序图显示突变所在位点单峰被双峰取代。见图３。图３　ＢＲＡＦ基因突变测序图３　讨　论ＢＲＡＦ基因突变在非肢端皮肤黑色素瘤中发生率较高，而在黏膜和肢端黑色素瘤中发生率较低。Ｍａｌｄｏｎａｄｏ等［６］分别对黏膜、肢端和非肢端皮肤黑色素瘤中ＢＲＡＦ基因的突变进行了检测，３种类型的突变率分别为９５％（２／２１）、１５４％（６／３９）和４３６％（２４／５５）。Ｃｏｈｅｎ［７］和Ｅｄｗａｒｄｓ等［８］也分别在相关的研究中检测到在肢端和黏膜部位（完全无日光照射）的黑色素瘤中ＢＲＡＦ突变发生率很低。我们对以上３个部位黑色素瘤的ＢＲＡＦ基因突变检测结果和以往国外的研究基本一致，即该基因的突变在非肢端皮肤黑色素瘤中更为多见。但我们也注意到以往对ＢＲＡＦ在黑色素瘤中的突变率的各研究报道中存在有较大的差异，这些差异可能是和样本量、研究所用组织标本以及肿瘤生长期等多方面的因素有关。在Ｄｏｎｇ等［９］进行的一项研究中发现处于放射生长期的黑色素瘤细胞中ＢＲＡＦ基因的突变率要远低于垂直生长期的黑色素瘤细胞。不同部位黑色素瘤中ＢＲＡＦ基因突变率的差异可能与是否接受紫外线照射（ＵＶ）及照射的长短有一定的关系，以往的大量研究已证实在接受日光照射部位发生的皮肤黑色素瘤中ＢＲＡＦ的突变率明显高于非日光照射部位如足底、手掌、甲下等肢端部位以及黏膜部位的黑色素瘤［６，８］。Ｌａｓｓａｃｈｅｒ等［１０］的研究也发现在接受ＵＶ照射治疗的银屑病患者照射部位的黑痣中ＢＲＡＦ基因Ｖ６００Ｅ突变发生率较高。这些研究结果都强烈地提示ＵＶ照射和ＢＲＡＦ基因突变之间的相关性。但是，ＵＶ照射至ＢＲＡＦ基因突变的具体机制目前还没有定论，Ｔｈｏｍａｓ等［１１］认为这很有可能是由ＵＶ照射后ＤＮＡ损伤修复过程中碱基的错误配对所造成的。我们的研究中所检测到的ＢＲＡＦ基因的突变形式包括点突变和串联突变，共检测到５种类型的点突变和１例串联突变，这些突变类型在以往的研究中均有报道。Ｖ６００Ｅ仍是最为常见的点突变类型，它占ＢＲＡＦ第１５外显子突变的８３３％，研究证实Ｖ６００Ｅ突变能够模拟Ｔ５９８和Ｓ６０１两个位点的磷酸化，使ＢＲＡＦ蛋白激活［２］，激活后的ＢＲＡＦ通过下游ＭＥＫＥＲＫ传导通路刺激细胞的增殖和分化［１２］。其他一些在ＢＲＡＦ基因突变中发生率较小的突变类型也可通过直接激活ＢＲＡＦ或者是通过ＣＲＡＦ间接地激活下游ＭＥＫＥＲＫ传导通路［１２］。自２００２年Ｄａｖｉｅｓ等