第三章食品微生物检验的试剂及配制

1/14/2020-page1h:\marco\industry\Foodmedia1/14/2020-page2h:\marco\industry\Foodmedia了解染色的基本原理。掌握常用染料的性质及其染色的配制技术。熟悉常用试剂、缓冲溶液、物质的量浓度的配制技术。了解培养基的种类及一些常见培养基的用途，掌握一般培养基的配制技术。1/14/2020-page3h:\marco\industry\Foodmedia第一节染料及染液配制技术一、染色原理微生物染色的基本原理，是借助物理和化学因素的作用而进行的。物理因素：细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素：正负离子之间的相互吸引等。1/14/2020-page4h:\marco\industry\Foodmedia二、染料的种类染料按其电离后所带电荷的性质可分为以下类型：1.酸性染料：如酸性复红、刚果红、伊红、藻红、苯胺黑、苦味酸等。2.碱性染料：一般有碱性复红、中性红、孔雀绿、番红、结晶紫、美兰、甲基紫等，细菌易被碱性染料染色。3.中性（复合）染料：如伊红美兰等，瑞脱氏（Wright）染料和基姆萨氏（Gimsa）染料等（常用于细胞核染色）。4.单纯染色：这类染料的化学亲和力低，大多是偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶剂中，如苏丹类（Sudanb)的染料1/14/2020-page7h:\marco\industry\Foodmedia1/14/2020-page8h:\marco\industry\Foodmedia三、常用染液的配制1.常用染料的溶解度表3-12.常用染料的配制1/14/2020-page9h:\marco\industry\Foodmedia第二节常用试剂的配制技术一、缓冲液的配制技术1/14/2020-page10h:\marco\industry\Foodmedia二、物质的量浓度溶液的配制技术1.溶液浓度表示法2.物质的量浓度溶液的配制方法3.溶液浓度的调整4.常用酸碱的物质的量浓度计算1/14/2020-page11h:\marco\industry\Foodmedia三、pH指示剂的配制技术1/14/2020-page12h:\marco\industry\Foodmedia四、血清学反应试剂制备技术血清学实验在第五章讲解1/14/2020-page13h:\marco\industry\Foodmedia五、生化试剂制备技术及试验法什么是微生物生化试验?指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。由于细菌各自酶系统不同，新陈代谢的产物也有所不同，而这些产物又各具有不同的生物化学特性。为此，可利用生物化学的方法来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的细菌。细菌的生化反应检查法1.在培养物中加入某种底物与指示剂，经接种、培养后，观察培养基的pH值变化。2.在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。3.根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。4.根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。1/14/2020-page15h:\marco\industry\Foodmedia生化试验的注意事项1.待检菌应是新鲜培养物。培养18-24h。2.待检菌应是纯种培养物。3.遵守观察反应的时间。观察结果的时间，多为24或48小时。4.应做必要的对照试验。5.提高阳性检出率，至少挑取2-3个待检的疑似菌落分别进行试验。1/14/2020-page16h:\marco\industry\Foodmedia生化试验分类（一）糖（醇）类代谢试验（二）氨基酸和蛋白质代谢试验（三）有机酸盐和铵盐代谢试验（四）酶类试验（一）糖（醇）类代谢试验1.糖醇类发酵试验2.V-P试验3.甲基红（MethylRed）试验MR1.糖醇类发酵试验原理：不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇，有的只能分解1~2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。糖发酵试验原理不同微生物发酵糖的能力各异，产生的分解产物也不同，可以作为细菌分类鉴定的手段。大肠埃希菌/产气肠杆菌葡萄糖CH3COCOOHHCOOH甲酸解氢酶H2+CO2伤寒沙门菌葡萄糖CH3COCOOHHCOOH指示剂：溴麝香草酚蓝pH6.3(黄)；6.3pH7.2(绿)；pH7.2(蓝)pH6.3pH7.2举例常用的糖醇单糖：葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖双糖：乳糖、蔗糖、麦芽糖三糖：棉子糖多糖：菊糖、肝糖、淀粉醇类：甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇2）试验操作方法以无菌操作的方法将经分离培养的纯种细菌用接种针或环移取，接种于糖发酵管中，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。置36±1.0℃置温箱内培养经一定时间(数小时至二周)培养，然后每天观察结果。•1.糖发酵试验要注意杜氏小管的置入方法；•2.在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。注意事项气泡导管气泡阳性阳性阴性结果记录：产酸不产气，阳性，以“+”表示产酸产气，阳性，以“⊕”表示不产酸产气，阴性，以“-”表示2.V-P试验（乙酰甲基甲醇试验）1）原理：某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。某些细菌在糖代谢过程中，经糖酵解途径产生丙酮酸。因不同细菌所含酶不同，进一步对丙酮酸的代谢也不同。大肠埃希菌产气肠杆菌2CH3COCOOHCH3COCHOHCH3+2CO2O2+KOHCH3COCHOHCH3CH3COCOCH3CH3COCOCH3+胍基红色化合物+H2OVP试验阴性。VP试验（V）实验原理举例2）V.P.试验取3支葡萄糖蛋白胨水培养基，1号接种大肠杆菌，2号接产气杆菌，第3支接未知菌。37℃培养48h后，加入40%KOH5~10滴，然后再加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温30min，以加快反应速度。观察培养基的颜色变化。3）结果观察与记录（1）发酵管出现红色者，为阳性，记V-P+（2）发酵管为黄色或铜绿色者，为阴性，记V-P-注意事项VP实验一定要注意开盖振荡！且反应时间较长。3.甲基红（MR）试验1）原理：肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。检测不同细菌分解葡萄糖产酸的能力。大肠埃希菌葡萄糖产气肠杆菌指示剂：甲酸乙酸乳酸琥珀酸等分解甲酸、乙醇和乙酰甲基甲醇pH5.4葡萄糖分解甲基红pH4.5(红)；pH5.4(橘黄色)。甲基红试验实验原理pH4.5pH5.4举例2）试验方法：挑取新鲜的待试培养物少许，接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基，于36±1℃或30℃（以30℃较好）培养3~5天，从第48h起，每日取培养液1ml，加入甲基红指示剂1~2滴，立即观察结果。3）结果观察与记录（1）呈鲜红色或橘红色为阳性，呈淡红色为弱阳性，记MR+；（2）呈橘黄色或黄色为阴性，记MR-，从发现阴性并培养至第5天仍为阴性，即可判定结果。MR-VP试验原理及照片V-P1.靛基质（吲哚）试验2.H2S试验3.尿素酶试验（二）氨基酸和蛋白质代谢试验1.吲哚试验（靛基质试验）1）原理：某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。史上最快最全的网络文档批量下载、上传、处理，尽在：吲哚试验色氨酸分解反应：吲哚反应：不同微生物所含酶系统不同，某些细菌含有色氨酸酶，能够分解培养基内蛋白胨中的色氨酸。大肠埃希菌色氨酸产气肠杆菌色氨酸酶+H2OCH3COCOOH吲哚+检测：吲哚+对二甲基氨基苯甲醛玫瑰吲哚+H2O玫瑰红色吲哚试验阳性+吲哚试验实验原理吲哚阴性-举例2）试验方法：取3支胰蛋白水培养基培养基，1号接种大肠杆菌，2号接种产气杆菌，第3支接未知菌。37℃培养24h～48h。沿试管壁滴加数滴吲哚试剂于培养物液面，观察结果。3）结果观察与记录呈现玫瑰红色,为阳性反应,记+无红色者,为阴性反应,记-靛基质试验原理及照片靛基质+2.硫化氢产生试验1）原理：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸生成H2S，H2S可与加入培养基中的铅或铁离子生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。)FeS(SOHFeSO4SHSHNHCOCOOHCHOHCOOHSHCHNHCH422233222黑色2）方法与结果(1)琼脂穿刺法：培养基：三糖铁培养基、含硫酸亚铁(或醋酸铅)的半固体培养基。操作：将试验细菌以接种针沿管壁穿刺接种到含醋酸铅或硫酸亚铁培养基中，经37℃24-48h培养后，观察结果。结果：培养基变黑色为阳性。当产生硫化氢量少时，为了便于观察结果，在穿刺接种培养时，一定要沿培养基管壁进行。(2)醋酸铅试纸法：培养基：含胱氨酸的半固体培养基、浸有醋酸铅的滤纸条。操作：待检菌穿刺接种培养基，悬挂醋酸铅纸条，37℃培养24-48h。结果：试纸呈黑色为阳性。该法较敏感。3）结果观察与记录培养基底部呈黑色，为阳性，记+培养基底部无黑色，为阴性，记-3.尿素分解试验尿素酶（Urease）试验1）原理：有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色。培养基由黄色变为红色，为阳性。以此鉴别细菌。1）未接种2）尿素酶阳性3）尿素酶阴性2）试验方法：挑取大量培养18~24h的待试菌，浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上，不要到达底部，留底部作变色对照。培养2、4和24h分别观察一次结果，培养基变为粉红色为阳性，颜色不变者为阴性。如阴性应继续培养至4天，作最终判定。尿素酶试验图阳性3）结果观察与记录培养基呈粉红色，为阳性，记+培养基颜色不变，为阴性，记-（三）呼吸酶类试验氧化酶试验过氧化氢酶试验硝酸盐还原试验氰化钾试验1.氧化酶试验1）原理:氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。试剂1%盐酸二甲基对苯二胺1%α-萘酚-乙醇液蓝色为+不变色或为粉红色为-2.过氧化氢酶试验1）原理：某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。2）试验方法用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1-2滴在培养物上,再加入1%α-萘酚-乙醇液1-2滴,在30秒内判定试验结果。3）结果观察与记录在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记+不变色或为粉红色者,为阴性,记-2）试验方法取固体培养基上的新鲜菌落一环，置于洁净玻片上（或试管），滴加3%过氧化氢液数滴，或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液，立即观察结果。3）结果观察与记录产生气泡者，为阳性，记+不产生气泡者，为阴性，记-3.硝酸盐还原试验1）原理：某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与α-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。试剂A、对氨基苯磺酸试剂B、α-萘胺试剂2）试验方法取待检菌新鲜纯培养物，在硝酸盐培养基上接种，在36±1℃培养1~4天，每天取2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀，立即观察结果。3）结果观