(第十章)第十二章植物的人工种子.

第十二章植物的人工种子授课老师：韦鹏霄第十二章植物的人工种子第一节人工种子的基本概念第二节人工种子的应用价值第三节人工种子的制作第四节人工种子的贮藏和萌发第五节人工种子中体细胞胚的变异第六节人工种子商品化生产的主要问题第七节人工种子研究进展与发展趋势第一节人工种子的基本概念人工种子（artificialseeds），又称合成种子（syntheticseeds）、人造种子（manmadeseeds）或无性种子（somaticseeds）。这一概念最初由Murashige（穆拉希格，1978）提出的。后来的科学家对这一概念下了各种定义，总之，（植物）人工种子的概念有狭义和广义之分。1、从狭义上：人工种子是指将植物离体培养中产生的胚状体（主要指体细胞胚）包裹在含有养分和具有保护功能的物质中形成的、并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。2、从广义上：人工种子可包括以下几种：（1）经过或不经过适应干燥处理，不经包裹成球，直接播种发芽的体细胞胚；（2）用聚氧乙烯（polyox）等多聚物将多个体细胞胚包裹成的饼状物；（3）将体细胞胚混在胶中，用流质播种法直接播种；（4）用凝胶包裹顶芽、腋芽、小鳞茎等。为统一，现我们定义为：植物人工种子——指用适当的方法包裹保持起来的，能保存，运输和供播种用的具有萌发力而成植株的胚状体或芽等繁殖器官。第一节人工种子的基本概念类型胚的起源种皮胚乳与胚的接触天然种子合子胚、不定胚天然形成生物学接触人工种子不定胚（胚状体）或顶芽、腋芽、小鳞茎等人工制作主要是物理接触第二节人工种子的应用价值就目前所知，植物人工种子可具有如下优点：1、对自然条件中不结实的或种子很昂贵的某些植物进行繁殖。2、繁殖速度快，且制作不受季节影响。3、用于“固定”杂种优势，使杂种一代（F1）可多代利用。4、有利于节约粮食和种源5、成为基因工程技术应用到生产中的桥梁。6、比天然种子具多功能性7、可以保存及快速繁殖脱病毒苗，并避免脱毒苗的繁殖过程中重新受病毒的感染。8、比普通试管苗成本低、运输方便，减少玻璃化苗。9、促进对细胞分化，胚状体及有性胚（合子胚）的生物学研究。第三节人工种子的制作一、人工种子的类型二、人工种子的制作过程第二节人工种子的应用价值由于人工种子具有以上这几方面的优点，因此，其应用前景是诱人的，引起世界各国的重视。80年代初，美国（如加州的植物遗传公司、植物DNA技术公司等）、日本、法国相继开展了植物人工种子的研究，并初步在胡萝卜、苜薯、芹菜、花椰菜、莴苣、花旗松等植物上制作人工种子成功。尔后，人工种子也纳入了欧洲尤里卡计划，以法国为主，与瑞士、西班牙等国合作。芬兰、印度、南朝鲜等也在进行研究。我国在“七五”期间，也开始将人工种子作为一种新的生物技术列入国家高技术发展计划（863计划），对胡萝卜、番木瓜，橡胶树等十几种植物进行了系统研究，其中胡萝卜、黄连、苜蓿等已得到大量的体细胞胚，制成的人工种子在无菌条件下可以转换成苗。表明我国在这一领域中的研究已取得很大进展。据不完全统计，目前已有40多种植物已成功地制成人工种子，有的已开始应用于生产。第三节人工种子的制作一、人工种子的类型目前已制成的人工种子体系主要有两种：带有胶囊外壳（种皮、基质）体系的人工种子和脱水人工种子。１、胶囊外壳体系人工种子（１）定义：这类人工种子是采用合适的胶（常用海藻酸盐）将体细胞胚或芽包裹而成。（２）基本结构：如图所示第三节人工种子的制作一、人工种子的类型（3）优点与缺点优点（4点）：1）颗粒小（直径约4mm）；2）胶珠对体细胞胚有保护作用；3）胶囊可作营养库（人工胚乳）；4）胶囊外有疏水性膜，可防胶囊破裂和失水，便于播种。缺点（5点）：1）大批制作人工胶囊在包封技术上还未能保证；2）贮藏的胶囊胚存活率降低；（与呼吸作用受阻有关）3）保水性差，营养易外渗，干燥后不易吸水回涨；4）胶囊易粘连，发霉；5）制作成本仍较高。第三节人工种子的制作一、人工种子的类型2、脱水人工种子此类人工种子是在胶囊包裹法的基础上发展起来的。最早由Kitto(1981)和Janick(1982)采用聚氧乙烯（PolyoxWSR-N）包埋胡萝卜体细胞胚状体，自然干燥后形成片状薄膜，重新吸水膨胀后即可播种。脱水人工种子可克服含水胶囊人工种子的某些缺点，使于贮藏，无需膜套。采用何种类型的人工种子，应根据植物的种类、体细胞胚质量、胶的类别以及制作目的和需要来选择。第三节人工种子的制作二、人工种子的制作过程（1）人工种子的制作和应用程序如下图所示：①愈伤组织的诱导→②体细胞胚的诱导（最好在发酵罐或生物反应器中进行）→③体细胞胚的同步化→④体细胞胚的分化→⑤体细胞胚的包裹→⑥包裹外膜→⑦贮藏→⑧发芽成苗试验→⑨体细胞变异程序与农艺研究。第三节人工种子的制作二、人工种子的制作过程（二）体细胞胚人工种子的制作主要包括胚状体的诱导和包裹制作两大方面。1、胚状体的诱导发生及筛选获得目前能大量产生体细胞胚的植物约有43科，92属，100余种。过去认为诱导胚状体比较困难的禾本科植物，如水稻、小麦、玉米、珍珠谷等植物，现在也都能通过离体培养产生胚状体。虽然，在植物组织培养中，不少植物都可诱导胚状体，但由于培养条件或植物激素的不适宜影响，常常使胚状体的发生频率很低，体积小，在发育上出现了子叶不对称，子叶连合成喇叭状，多子叶、子叶畸形、胚轴肥大肉质化及体胚发育受抑制而中途停顿等。在培养中发生的这些现象，使体细胞胚不宜或未达到制造人工种子的质量，而导致低的转换率。所以，体细胞胚的质量是影响人工种子转换率的一个重要的限制因素。第三节人工种子的制作二、人工种子的制作过程（1）人工种子对胚状体的要求1）播种后能很快发芽出苗；2）根与芽能几乎同时生长；3）下胚轴无膨大，无愈伤组织化；4）同步化程度较高，大小基本一致，发芽生长整齐；5）“种子”生活力强；（特别在不良环境中如低温、干旱中存活力强）6）发芽后幼苗形态与生长基本正常。（2）影响胚状体诱导发生的因素主要从材料的遗传基因型、外植体的来源和年龄、培养基种类和成分及浓度（如对植物激素、含氮化合物、含钾化合物、天然提取物等的使用）和培养条件等方面进行调控。第三节人工种子的制作二、人工种子的制作过程（3）人工种子胚状体获得的关键环节1）同步脱分化促进细胞的同步分裂。在外植体培养初期，可在培养基中加入DNA合成抑制剂，如五氨基尿密啶等，使细胞暂停DNA合成，然后又除去DNA合成抑制剂（换培养基，不加该剂即可），促使细胞同步分裂。2）高质量体细胞胚的获得可从几方面采取措施：（调控作用）a.生长素：主要为2.4-D的适宜使用、浓度b.氮的类型及用量：培养基中可加入2~4mg/l的甘氨酸或丙氨酸，特别是脯氨酸；酪蛋白水解物（CH），400mg/lc.碳源：可用麦芽糖（催熟因子），一般培养基用蔗糖。第三节人工种子的制作二、人工种子的制作过程3）分离筛选同步化的胚状体通过分离筛选出同步化的胚状体（把不同步化的胚状体去除）。常用的分离筛选方法有：a.密度梯度离心法：（Fujimura和Komamine,1984）含胚状体悬浮液在离心机上进行离心处理，分离出各种同步的胚状体。b.过滤分选法：（Warren和Fouler,1977）用一定规格大小的过滤器或滤网或滤膜，对含胚状体的悬浮液进行过滤分选。c.仪器分选法：（朱征等，1990）用专门仪器分选大小胚状体。在上述分离筛选方法中，以过滤分选法比较实用、有效和简捷。第三节人工种子的制作二、人工种子的制作过程2、人工种子的包胶制作胚状体（或芽）需要用胶囊包裹制成人工种子。（1）对胶囊的要求：胶囊相当于自然种子的种皮和胚乳（即起保护作用又能提供营养），因此，对制作人工种子的胶囊有一定的要求（即需要具备一定的条件）（5点）：1）有保护作用：可保护被包裹的胚状体免受外部伤害；2）种皮软硬适中：既不能太坚硬（以有利于发芽破胶），又不能太脆弱（以便于保存，运输），一般要求达到能承受0.2~0.8kg/颗的压力。3）能保持气体交换和适度水分：为胚状体生存的必需，胶囊要有一定的通透性。4）有必需的营养：以保证胚状体萌发和早期发育。第三节人工种子的制作二、人工种子的制作过程（2）包胶基质要达上述人工种子制作对胶囊的要求，首先要选择好的包胶基质。据对20多种高分子化合物和凝胶所作比较，以海藻酸盐是目前所用的较为合适的包胶基质。海藻酸钠，它是一种从海藻（如褐藻）中提取的多糖。（3）人工种皮包胶基质首先要起人工种皮作用，其次才是起“胚乳”作用。什么叫人工种皮？人工种皮是指胚状体（或芽）以外的部分的统称。以海藻酸钠制作较为适宜。第三节人工种子的制作二、人工种子的制作过程（4）人工胚乳什么叫人工胚乳？在包裹基质中附加入有关营养成分和其他成分即成“人工胚乳”。根据不同类型繁殖体而选定：（见下表1）附加成份繁殖体干燥胚或芽休眠微块茎、鳞茎含水胚状体、不定芽水凝胶胚乳不需要有益或不需要需要种皮有益有益需要营养及激素有益不需要或有益需要除草剂有益有益有益干燥保护剂需要不需要不需要杀虫剂需要需要需要杀菌剂需要需要需要有机氮吸附剂不需要不需要需要有益微生物有益有益有益表1不同类型繁殖体可能附加的成分植物名及繁殖体海藻酸钠浓度培养基和蔗糖浓度激素浓度（mg/L）转株率四会贡柑体细胞胚3%MT，4%GA1,IBA0.2530%~70%（无菌）唐菖蒲小球茎4%~5%1/2MS,1.5%IBA0.5,GA0.193%（有菌）热带兰花球茎4%改良MSNAA1,BA0.295%（有菌）赤桉微芽4%改良HNAA0.2~0.580~90（无菌）小麦体细胞胚6%1/4MSGA1,防腐剂20045%（有菌）IAA，活性炭表2几种植物人工种子的附加成分及转株率第四节人工种子的贮藏和萌发1、人工种子的贮藏方法（1）低温保存法：即在40℃（冰箱）下保存，大麦在6个月仍存活。不同植物时间不同。（2）低温和干燥或脱落酸（ABA）处理相结合法：即在40℃黑暗，ABA（10-7mol/L）条件下保存。（3）低温、干燥一液体石蜡结合法：即：干燥→液体石蜡→2℃保存4个月石蜡作用：减少水分蒸发。第四节人工种子的贮藏和萌发2、人工种子的播种与萌发成苗由人工种子转换成高质量苗应具有如下特征：（1）苗具有2片以上叶的顶端分生组织；（2）根具2cm以上的长度或根虽较短但具次生根；（3）根与茎直接相通，没有愈伤组织或下胚轴肿胀（肥大）现象；（4）绿色植物具有正常的表型。凡具有多茎、发育受阻或白化植株等均不是高质量苗。第五节人工种子中体细胞胚的变异目前研究主要为体细胞胚的子叶数目，如具单个、二个、三个、多个子叶。为减轻体细胞无性系变异的影响，目前已有研究采用顶芽、腋芽等繁殖器官制作人工种子。如桑树芽人工种子已有成功报道（Bapat等，1987）。第六节人工种子商品化生产的主要问题人工种子要进行商品化生产，需要解决如下5个问题：1、生产高质量的体细胞胚2、开发高质量的包裹基质（即“种皮”）3、研制适用于大规模制作人工种子的包胶装置4、克服体细胞无性系的变异和大田播种人工种子的缺陷5、降低成本第六节人工种子商品化生产的主要问题1、生产高质量的体细胞胚高质量的体细胞胚，必须具备下列特征：（1）形态与发芽（即具有根延长部分）与合子胚相似；（2）具有能发育成叶片的顶端分生组织和能产生根的胚根分生组织；（3）能产生与亲本相似的健壮植株。2、开发高质量的包裹基质（即“种皮”）目前，海藻酸盐所制成的“种皮”尚有许多缺点。寻找更合符理想的水凝胶，可在胶囊的外表包裹一层具有能进行气体交换又能保持“种皮”水分与差分球粒间彼此不会粘连发发霉的蒲膜，即为高质量的“种皮”。第六节人工种子商品化生产的主要问题3、研制适用于大规模制作人工种子的包胶装置如付晓棣等（1990）自制的人工种子滴制