T-RFLP

T-RFLP技术桂林医学院生物技术学院——程骏T-RFLP简介T-RFLP中文全称是末端限制性片段长度多态性（Terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism）,又可以称为16sRNA基因的末端限制性片段分析技术。它是将目标DNA片段的一个末端(通常是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段长度的大小和荧光强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样品图谱间波峰的异同，就可以得到不同样品中菌群的差异。T-RFLP原理T-RFLP的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个引物的5‘末端用荧光物质标记，常用荧光物质有HEX,TET,6-FAM等。提取待分析样中的DNA，以它为模板进行PCR扩增，所得到的PCR产物的一段就带有这种荧光标记，然后PCR产物用合适的限制性内切酶进行消化，一般选用酶切位点为4bp的限制性内切酶。由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的差异，酶切位点就会存在差异，酶切后就会产生很多不同长度的限制性片段。消化产物用自动测序仪进行测定，只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。因为不同长度的末端限制性片段必然代表不同的细菌，通过检测这些末端标记的片段就可以反应微生物群落的组成情况。这种方法还可以进行定量分析，在基因扫描图谱上，每个峰面积占总峰面积的百分数代表这个末端限制性片段的相对数量，即末端限制性片段的数量越大其所对应的面积越大。T-RFLP流程简单的流程图：3.1把样本的基因组提取出来3.2以提取出来的基因组DNA为模板进行PCR反应，引物的5′端带有荧光标记物3.3将纯化过的PCR产物用限制性酶进行酶切3.4将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳得到大概的电泳条带图，以方便检测酶切是否完全3.5酶切产物在DNA测序仪(ABI3730，美国)中进行毛细管电泳检测，所得电泳图谱用片段分析软件Genescan(ABI，美国)进行分析3.6图谱分析及数据分析PCR（纯化）我的实验目的和实验方法最初是要研究IL-10这个基因对于人体有什么作用，因此用了两种小鼠来做研究，一组是正常小鼠，一组是IL-10基因敲除的小鼠，通过T-RFLP这个技术来研究两组小鼠在肠道菌群上的差异，从而了解IL-10基因对于动物肠道菌群的影响，得到这一方面的研究成果。具体的实验步骤一、提取样本的基因组我提取的是小鼠粪便的基因组，用自己实验室配制的粪便基因组提取试剂盒来抽提，基因组提取的结果良好。二、PCRPCR条件：95℃，5min变性95℃，30S退火55℃，30S37个循环延伸72℃，2min72℃，10min，4℃保存。然后用DNA凝胶回收试剂盒（上海中亚）对PCR产物做一个回收，以去掉PCR反应中的杂带，保证只有800bp大小的DNA片段，去掉杂带。下面是一次实验十六个样本PCR后的电泳图，我们PCR得到的DNA片段一定要是800bp位置的，不可出现杂带，而且对于PCR的污染要求很严格，因为这个实验用的引物是通用引物，基本上所有的生物基因组都可以P出这样的条带，所以对于所用试剂、耗材、环境要求很高，否则最后结果没有说服性。750bp三、酶切选用HhaⅠ作为实验的限制性内切酶，酶切位点是GCG^C酶切体系采用40μL,PCR产物为6μL,在37°C酶切6h,反应完成后,HhaⅠ在65°C水浴中20min失活。酶切时间一定要控制好，不能太短，酶切没有结束就停止，因此要酶切一段时间进行一次电泳，看条带结果，决定是否停止酶切，一般都需要4~8小时。下面是一张酶切不完全的电泳图四、送去做T-RFLP的测序这个实验测序是送去生工做的测序，用的是DNA测序仪ABI3730，大约3~4天能拿到，因此我的实验部分大约两周能做一次。五、图谱分析和数据分析这是两个同组样本的图谱，波峰大致上是相同的，这样表明这两个样本数据是比较可靠的。T-RFLP统计学分析对于每个图谱数据的预处理，去除荧光强度小于100和片段大小≦35或者≥500的片段数据，将剩下片段的峰面积进行标准化处理，并去除相对丰度小于1％的片段[7][8]。这批样本一共十六个，分为对照组和干预组，通过统计学分析得到右边的数据，和图谱吻合。此外还作了聚类分析，就是将T-RFLP的数据转换成1～0矩阵（1表示有，0表示无），利用SPSS16.0中的聚类分析工具（Classifiy-hierarchicalAnalysis），采用非加权配对算法平均法对每组样本进行聚类分析。接下来用软件SPSS16.0进行物种丰度（S）、BCI和Shannon-Weiner指数（H）的计算，就不再一一赘述。总结IL-10基因的发现及IL-10细胞因子在动物体中的重要作用越来越引起大家的注意，特别是其在免疫系统中的作用。通过T-RFLP技术得到的数据，我们可以初步判定IL-10基因对于小鼠的肠道菌群是有很大影响的，正常小鼠和IL-10基因敲除小鼠之间肠道菌群存在很大差异，至少有一种或多种菌群在数量上差异很大。由于在时间、知识和现有条件的情况下，这个实验没有得到关于具体菌群方面的结论。不过仅仅是通过数据我们就能得到比较丰富的结论了，随着T-RFLP技术越来越被广泛应用在医学、环境学、地质地理学和微生物学的研究中，我想这项技术在国内会发挥重要作用。