05第五讲蛋白质结构解析技术(二).

第五讲蛋白质结构解析技术（二）1.氨基酸序列分析2.X-射线衍射技术3.核磁共振4.质谱技术5.结构分析的其它方法①现代光谱技术②三维电镜重构技术③动力学全局研究技术主要内容第三节核磁共振技术NuclearMagneticResonance1.概述2.原理3.基本概念4.核磁共振结构测定基本程序5.适用范围及优缺点一、概述1、核磁共振2、简单历史回顾3、核磁共振仪器的进展一、概述1、核磁共振（Nuclearmagneticresonance,NMR）在静磁场中，自旋的原子核发生能级（塞曼）分裂，特征能量的电磁波引起原子核磁能级共振跃迁并吸收特征能量电磁波的现象。称为“核磁共振”或“核移跃迁”。电磁波与磁场中的原子核作相互用，产生核磁共振。NMR属于吸收光谱，与UV-vis和红外光谱法类似。•核磁共振波谱学是光谱学的一个分支，处于电磁波的最低端——无线电波段。•是物质结构定性分析最强有力的工具之一，亦可进行定量分析。如：测定有机化合物的结构1HNMR──分子中氢原子的位置、环境以及官能团和C骨架上的H原子相对数。CHCH2CH3中H的比值或相对数量2、简单历史回顾1946年F.Bloch(斯坦福大学)&EMPurcell（哈弗大学）领导的两个小组几乎同时观察到核磁共振现象。Bloch水中质子的信号，Purcell石蜡中质子共振信号，1952年获Nobel物理奖1950发现化学位移，随后偶合常数，弛豫时间，引起化学界高度重视1953年第一台核磁共振仪器问世，1H研究较成熟1970年脉冲傅里叶变换核磁共振仪，灵敏度提高，13C核磁共振蓬勃发展。1971年Jeener二维核磁谱建立了化学位移与偶合常数的关系、同核和异核成键作用的关系、空间作用的关系，分析物质的空间结构。1987年Emst论述了二维NMR理论和实验原理（91年获诺奖），在此基础上，学术界开展了多核NMR深入研究。NMR在固态分析发展1971年ERAndrew固体NMR研究，1976年MMehring固体NMR专著，1993年专著—固体NMR高分辨率原理NMR成像技术的发展1973年美Paul.C.Lauterbur核磁共振成像技术。物理学随着无线电电子学、数学图像处理、计算机技术、应用数学等领域随后，在医学领域NMR成像系统及广泛应用06:01:173、核磁共振仪器的进展核磁共振在仪器、实验方法、理论和应用等方面飞跃进步。谱仪频率已从30MHz发展到1000MHz。仪器工作方式从连续波谱仪发展到脉冲-傅里叶变换谱仪。谱图已从一维谱到二维谱、三维谱甚至更高维谱。应用学科从化学、物理扩展到生物、医学等多个学科。核磁共振成像技术还可以与断层扫描技术(CT)结合为临床诊断和生理学、医学研究提供重要数据总之，核磁共振已成为最重要的仪器分析手段之一。06:01:17在医学诊断中NMR的优势是诊断早期病变的临床医学影像技术，对患者和检查者安全。相对于X-射线透视技术和放射造影技术，NMR对人体辐射小。相对于超声探测技术，NMR成像更加清晰，显示更多细节。相对于其他成像技术，核磁共振成像不仅仅能够显示有形的实体病变，而且还能够对脑、心、肝等功能性反应进行精确的判定在帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、癌症等疾病的诊断方面，NMR技术都发挥了非常重要的作用。经典核磁共振波谱仪傅立叶变换核磁共振波谱仪不是通过扫场或扫频产生共振；恒定磁场，施加全频脉冲，产生共振，采集产生的感应电流信号，经过傅立叶变换获得一般核磁共振谱图。（类似于一台多道仪）超导核磁共振波谱仪：永久磁铁和电磁铁：磁场强度25kG超导磁体：铌钛或铌锡合金等超导材料制备的超导线圈；在低温4K，处于超导状态；磁场强度100kG开始时，大电流一次性励磁后，闭合线圈，产生稳定的磁场，长年保持不变；温度升高，“失超”；重新励磁。超导核磁共振波谱仪：200-400HMz；可高达600-700HMz；核磁共振应用•核磁共振适合于液体、固体。如今的高分辨技术，还将核磁用于了半固体及微量样品的研究。核磁谱图已经从过去的一维谱图（1D）发展到如今的二维（2D）、三维（3D）甚至四维（4D）谱图，陈旧的实验方法被放弃，新的实验方法迅速发展，它们将分子结构和分子间的关系表现得更加清晰。•在世界的许多大学、研究机构和企业集团，都可以听到核磁共振这个名词，包括我们在日常生活中熟悉的大集团。而且它在化工、石油、橡胶、建材、食品、冶金、地质、国防、环保、纺织及其它工业部门用途日益广泛。•在中国，其应用主要在基础研究方面，企业和商业应用普及率不高，主要原因是产品开发不够、使用成本较高。但在石油化工、医疗诊断方法应用较多。作为蛋白质的结构测定和解析中有力工具一些实际的应用•分子结构的测定•化学位移各向异性的研究•金属离子同位素的应用•动力学核磁研究•质子密度成像•T1T2成像•化学位移成像•其它核的成像•指定部位的高分辨成像•元素的定量分析•有机化合物的结构解析•表面化学•有机化合物中异构体的区分和确定•大分子化学结构的分析•生物膜和脂质的多形性研究•脂质双分子层的脂质分子动态结构•生物膜蛋白质——脂质的互相作用•压力作用下血红蛋白质结构的变化•生物体中水的研究•生命组织研究中的应用•生物化学中的应用•在表面活性剂方面的研究•原油的定性鉴定和结构分析•沥青化学结构分析•涂料分析•农药鉴定•食品分析•药品鉴定二、核磁共振基本原理•核磁共振的基本原理–原子核的自旋和磁矩–核的进动和磁能级–核磁共振的条件–弛豫过程•核磁共振仪器的工作原理–工作原理–实现核磁共振的两种方法–样品制备方法要求掌握1、原子核的自旋和磁矩（1）核自旋I：自旋量子数；h：Planck常数；P：自旋角动量质量数原子序数自旋量子数实例偶数偶数012C,16O,32S,28Si,30Si,32S等奇数奇数或偶数1/21H,13C,15N,19F,29Si,31P等奇数奇数或偶数3/2，5/2…..11B,17O,33S,35Cl,37Cl,127I等偶数奇数1,2,3……2H,10B,14N等原子核的自旋量子数核自旋具有角动量（矢量）核自旋角动量和自旋量子数的关系式：（一）核磁共振的基本原理（2）磁矩原子核是带电粒子，自旋运动时产生磁场，形成磁偶极子，具有磁的性质。核磁矩(μ)：两个磁极间的磁偶极的大小，矢量，方向与和自旋角动量（P）重合。其大小关系：μ=P其中为核磁旋比（磁矩和P的比值）自旋角动量(P)是量子化的，根据量子学原则，在外加磁场（H0）方向(沿z轴)的分量（Pz），是h/(2π)的倍数，倍数可用自旋量子数（I）表示2、核的进动和磁能级（1）核的进动自旋核在外加磁场中，核自旋行为像重力场中旋转的陀螺，核一方面自旋，一方面围绕磁场旋转，这种运动方式称进动，也称拉莫尔（Larmor）进动。核自旋轴（同核磁矩矢量重合）和H0轴（回旋轴）成一角度（θ），自旋核就绕H0轴进动。进动频率（ν0）称Larmor频率，Larmor频率随磁场强度增大而增大（ν0∝H0）陀螺的旋进运动模拟外磁场中的磁性核（2）核能分裂（磁能级）根磁学原理，核磁矩在外磁场（H0）中的具有能量（E）磁量子数（m)：自旋核在H0中有不同取向，m共有（2I+1）个取向，每个自旋取向代表原子核处于某种特定能量状态，称为~。若I=1/2，则有2种取向，磁能级不同m=+1/2，E（+1/2）=-μzH0（能量低）；m=-1/2，E（-1/2）=+μzH0（能量高）（负号：表示“核磁矩（μ）与H0的方向”，顺向能量低，反向能量高）2种取向（磁能级）的能量差ΔE=E（-1/2）-E（+1/2）小结核磁共振现象自旋量子数I=1/2的原子核（如：1H），可当作电荷均匀分布的球体，绕自旋轴转动时，产生磁场，类似一个小磁铁。当置于外磁场H0中时，相对于外磁场，m有（2I+1）种取向：氢核（I=1/2），两种取向（两个能级）：(1)与外磁场平行，能量低，磁量子数ｍ＝＋1/2;(2)与外磁场相反，能量高，磁量子数ｍ＝－1/2;发生核磁共振，就要吸收特征能量。3、核磁共振条件在外磁场（H0）中，原子核能级裂分。射频振荡线圈产生电磁波，产生与H0垂直的震荡磁场H1。改变射频，其频率与自旋核的Larmor进动频率（ν0）相等时核吸收射频波的能量，由低能级向高能级跃迁，即核磁共振共振条件：射频磁场的频率（ν）ν=ν0=H0/(2)如：H0=14092Gsν=H0/(2)=60MHzν=ν0=H0/(2)推论若磁场固定，频率（ν）值取决于磁旋比（）值不同的核，在同一磁场中发生核跃迁的频率不同如：1H和19F，HF，1H需要比19F更大的射频才能发生共振某一射频只能观察一种核的核磁共振（NMR）若固定射频（ν），19F比1H需要更大的H0才能发生共振4、弛豫过程？：通过非辐射方式使高能态核回到低能态的过程，保持低能态核数始终大于高能态核数，这个过程称~。弛豫过程的方式（2种）：（1）纵向弛豫（T1）（自旋-晶格）：高能级核将能量传递给周围的分子（固体或液态），最终变为热运动，自旋核回到低能级的过程。非碰撞传递，传递给回旋频率相等的物质。T1：液态快，固体慢（2）横向弛豫（T2）（自旋-自旋弛豫）：一个自旋核与另一个自旋核交换能量的过程。各种能级的核数量不变，系统总能量不变。T2：固体快、液态慢（二）核磁共振波谱仪工作原理1、工作原理1．永久磁铁：提供外磁场，要求稳定性好，均匀，不均匀性小于六千万分之一。外绕扫场线圈。2．射频振荡器：线圈垂直于外磁场，发射一定频率的电磁辐射信号。如：60MHz或100MHz。3．射频信号接受器（检测器）：当质子的进动频率与辐射频率相匹配时，发生能级跃迁，吸收能量，在感应线圈中产生毫伏级信号。4．样品管：外径5mm玻璃管，测量过程中旋转，磁场作用均匀。2、实现核磁共振的两种方法（1）扫场法:ν不变，改变H0（常用）（2）扫频法:H0不变，改变νν=ν0=H0/(2)3、样品的制备：试样浓度：5~10%；需要纯样品15~30mg；傅立叶变换核磁共振波谱仪——需要纯样品1mg；标样浓度（四甲基硅烷TMS）：1%；溶剂：1H谱——四氯化碳，二硫化碳；氘代溶剂：氯仿，丙酮、苯、二甲基亚砜的氘代物；三、核磁共振与化学位移化学位移的产生及表示方法影响化学位移的因素有机化合物化学位移简单介绍1、化学位移的产生及表示方法（1）化学位移化合物结构中不同位置的原子核，周围的电子云密度不同，核磁共振的频率有差异，即引起共振吸收峰的位移，这种现象称为化学位移。——反映质子核所处的化学环境。物质中所有质子核磁共振频率是否相同呢？共振条件可知：ν=ν0=•H0/(2)强度一定的磁场中，H0=14092Gs质子产生的核磁共振频率也一定，即为60MHz则化合物中所有的质子处于一个吸收峰，实际上并非如此，Why？1HNMR:CH3—OH质子化学位移不同的原因分子中没有完全裸露孤立存在的质子给定照射频率下，原子核外电子云产生感应磁场，与H0磁场方向相反，对H0的磁场具有屏蔽作用。质子产生共振需要更大的外磁场强度（相对于裸露的氢核），来抵消屏蔽影响。感生磁场强度与H0关系感生磁场强度——以屏蔽常数（σ)表示，与H0成正比例关系，电子云密度越大、屏蔽作用越大、σ越大质子核感受到的磁场强度将减小：H0(1-σ)：核共振吸收的频率与H0的关系：0=[/(2)]H0(1-)屏蔽常数“σ”反映电子云对质子的屏蔽作用—不同环境中的质子发生不同的化学位移（2）化学位移表示方法从吸收频率来看，“化学位移”的单位为“Hz”60MHz仪器，质子共振频率变化约在1000Hz100MHz仪器，质子共振频率的变化约在1700HzH0不同，共振产生的频率不同，无法比较。要求测定几个Hz的精度，测定绝对值非常困难因此，采用相对值的方法表示“化学位移”（A）1970年IUPAC（国际纯粹与应用化学协会）建议：化学位移用位移