09高效液相色谱法检验操作规程

云南润益生物科技有限公司GMP文件文件题目高效液相色谱法检验操作规程编码：ZL-SOP(TY)-1009-00共9页第1页制定人日期审核人日期QA审阅日期批准人日期颁发部门质量管理部□√新订□修订生效日期分发部门质量管理部、技术部目的：建立高效液相色谱法的标准操作规程。范围：本规程适用于高效液相色谱法。职责：检验员、QC主任。依据：《中国药典》2010年版。内容：高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，用积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。1对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。1.1色谱柱常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色谱；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。孔径在15nm(1nm=10Å)以下的填料适用于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，分析的填充剂粒径一般在3～10μm之间。粒径更小（2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹云南润益生物科技有限公司GMP文件文件题目高效液相色谱法检验操作规程编码：ZL-SOP(TY)-1009-00共9页第2页配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。流动相的pH值应控制在2～8之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶溶解；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，有机无机杂化填充剂等。1.2检测器最常用的为可变波长的紫外-可见光检测器，包括二极管阵列检测器、其他常见的检测器有荧光检测器、电化学检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、质谱检测器等。紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录待测物的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与与待测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与与待测溶液的浓度通常呈脂数关系，故进行计算时，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同，如采用紫外-可见光检测器，所用流动相应符合紫外-可见分光光度法项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中有机溶剂的截取使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发性盐组分的流动相。1.3流动相反相色谱系统的流动相首选甲醇-水系统（采用紫外末端波长检测时，首选乙腈-水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有缓冲液云南润益生物科技有限公司GMP文件文件题目高效液相色谱法检验操作规程编码：ZL-SOP(TY)-1009-00共9页第3页的流动相，必要使用时，尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为因定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比较低者（小于或等于50%）相对改变量不超过±30%且绝对改变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的数值超过10%时，则改变量以10%为限。对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下说明。2系统适用性试验系统适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个参数。其中分离度和重复性尤为重要。按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。2.1色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的性能，由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（W）或半峰高宽（Wh/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。2.2分离度（R）用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分(内标物质或其他难分离物质)的分离度，或将云南润益生物科技有限公司GMP文件文件题目高效液相色谱法检验操作规程编码：ZL-SOP(TY)-1009-00共9页第4页供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。无论定性还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，分离度应大于1.5。分离度（R）的计算公式为：R=2(tR2-tR1)/(W1+W2)或R=2(tR2-tR1)/1.70(W1.h/2+W2.h/2)式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2及W1.h/2、W2.h/2为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽。2.3重复性用于评价连续进样后，色谱系统响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。2.4拖尾因子（T）用于评价色谱峰的对称性。为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定，拖尾因子计算公式为：T=W0.05h/2d1式中W0.05h为5%峰高处的峰宽；d1为5%峰高出峰顶点至峰前沿之间的距离。除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确测量。必要时，应在各品种项下对拖尾因子作出规定。3测定法定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。测定杂质含量时，须采用峰面积法。云南润益生物科技有限公司GMP文件文件题目高效液相色谱法检验操作规程编码：ZL-SOP(TY)-1009-00共9页第5页3.1内标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：校正因子（ƒ）=（As/Cs）/（AR/CR）式中As为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；Cs为内标物质的浓度；CR为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图。测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：含量（Cx）=ƒ·Ax/（As/Cs）式中Ax为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；Cx为供试品（或其杂质）的浓度。ƒ、As和Cs的意义同上。当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。采用内标法，可避免因样品前处理或进样体积误差对测量结果的影响。3.2外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：含量（Cx）=CR（Ax/AR）式中各符号意义同上。3.3加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因云南润益生物科技有限公司GMP文件文件题目高效液相色谱法检验操作规程编码：ZL-SOP(TY)-1009-00共9页第6页子的溶液，进样，记录色谱图，按上述3．1法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位。其数值一并载入各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分（面积约为通常条件下满量程峰积分值的10%）。[通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%；含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于5%；含量大于2%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于2%。]然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。3.4不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，若没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述3.3法配制对照溶液并调节仪器灵敏度后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图I，再记录等体积纯溶剂峰的色谱图II。色谱图I上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图II上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。3.5面积归一化法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图，测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积