11第十一讲蛋白质的分离与纯化(二).

第十一讲蛋白质的分离与纯化（二）第一节分离纯化概述第二节纯化前处理第三节初级分离第四节精制分离—色谱技术第五节分离方案和纯度鉴定一、问答题（每题5分共30分）：1.蛋白质工程的基本途径或主要步骤2.什么是构型、构型，二者的主要差别。3.Anfinsen原理及其意义。4.紫外可见吸收光谱和荧光光谱。5.什么是核磁共振（NMR）？实现核磁共振的两种方法是什么？6.什么是化学位移？1970年IUPAC规定，衡量化学位移的相对标准是什么？规定其化学位移常数是多少？表示化学位移物理量的符号和单位的符号各是什么？蛋白质工程期中考试（20140514）分析二、简述题（每题10分共40分）1.蛋白质一级结构、二级结构、超二级结构、结构域和三级结构及其主要作用力？它们之间的相互关系怎样？2.如何理解蛋白质工程的含义（狭义和广义理解），其主线是什么？3.什么是基因突变技术，包括哪两大类技术？举例说明这两大类技术包括哪些方法。4.预测蛋白质三级结构的方法有哪些？描述一种你熟悉的蛋白质高级结构预测方法的操作流程。三、方案设计（10分）某种微生物合成的蛋白酶与人体消化液中的蛋白酶的结构和功能很相似，但对热稳定性较差，进入人体后容易失效，现要将此酶开发成一种片剂，临床治疗消化不良，通过蛋白质工程手段能否提高蛋白质的稳定性，请您试设计两套改造方案，简述改造方案依据的原理。•提示和要求：一套方案采用分子生物学修饰，另一套采用化学修饰。四、论述题（20分）：•论述蛋白质一级结构测定的基本程序以及主要方法和原理。•概述•常见色谱技术介绍第四节精制分离—液相色谱技术1、液相色谱（Liquidchromatography）？利用不同物质在固定性和流动相中的分配特性不同，对物质的分离的技术。（理解）–依据物质的理化特性（如：分子大小、形状、分子极性、电荷等）不同，–在固定性和流动相中的分配系数不同–流动相为平推流–流动相流过固定相时，两相之间分配平衡很快–不同物质的流动速度不同而实现分离。–又称为层析（平推流）特点（四高）高效率、高纯度、高精度、高自动化程度——现代化色谱技术——高效液相色谱一、概述1850年，德国化学家Runge将古罗马时期分析染料与色素的方法进行改进，发展成为纸色谱。1903年，俄国植物学家Tsweet在华沙生物学会议上发表分离植物色素的论文，1906年，Tsweet首次提出“色谱法”和“色谱图”的概念。“色谱法”（Chromotography）“色谱图”（Chromatogram）1941年，英国生物化学家Martin与英国化学家Synge（获诺贝尔奖）创立液液分配色谱，以水份饱和硅胶为固定相，含乙醇的氯仿为流动相分离乙酰氨基酸。1970年中期，微处理机技术用于液相色谱，提高了液相色谱的自动化水平和分析精度。80年代，色谱联用技术发展迅速，逐渐出现了色谱—光谱联用、色谱—质谱联用、二维色谱（色谱—色谱）等技术。1990年以后，生物工程和生命科学的迅速发展，为高效液相色谱技术提出了更多、更新的分离、纯化、制备的课题，促进了高效液相色谱技术的发展。2、液相色谱法的发展•在色谱技术中，液相色谱（Liquidchromatography）是最早（1903年）发明的，但其初期发展比较慢。•液相色谱普及之前，纸色谱、气相色谱和薄层色谱是色谱分析的主流。•20th60S’，将较为成熟的气相色谱理论与技术应用于液相色谱，使液相色谱迅速发展。•特别是填料（色谱柱）制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。•1969年，液相色谱仪商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱被称为高效液相色谱法（HPLC）•更加微量、快速、高效、广泛。•新进展：微柱—HPLC、无孔色谱短柱—HPLC、毛细管—HPLC2、液相色谱的发展1.吸附层析adsorptionchromatography2.分子筛层析molecularsievechromatography3.离子交换层析ionexchangechromatography4.亲和层析affinitychromatography5.分配色谱—液-液色谱6.疏水色谱—疏水作用7.等电点聚焦色谱—pI8.高效液相色谱—高度自动化的液相色谱3、液相色谱的类型1、吸附分离色谱？（1）概念：利用固相吸附剂对不同物质的吸附力不同，进行物质分离的液相色谱技术。（2）原理：通过范德华力，流动相中的分子与固定相（吸附剂）吸附、再解吸附进入流动相（洗脱剂）。不同物质在固相和液相之间分配系数或解离平衡不同。通过连续的吸附—解吸附—再吸附过程将物质分离。二、常见色谱介绍（3）影响因素？吸附剂、溶剂、被分离物质的性质“三方面”吸附剂：凡能对其它物质具有吸附作用的固体物质。吸附剂选择原则：根据：吸附剂性质、溶剂的性质、被分离对象的性质——选择。表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉。如何理解——选择原则？（三者之间相互影响关系）：极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性强的吸附剂易吸附非极性强的物质。为了便于解吸附，对于极性大的分离物，选择极性较小的吸附剂，反之亦然。极性吸附剂、分离弱极性物质、弱极性溶剂洗脱；分离强极性物质、用强极性溶剂理想吸附剂和溶剂的选择：依据原则，依靠经验和多次试验。常用吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰胺、硅藻土、羟基磷灰石等硅胶的硅醇基（分离中性和酸性成分）氧化铝：多孔Al2O3，分三种：酸性氧化铝、中性氧化铝、碱性氧化铝活性炭：非极性吸附剂、常用于脱色和脱臭等吸附过程层析方式（2种）：柱层析：羟基磷灰石（HA），[Ca3(PO4)3OH2]，酸性蛋白质、酶、核酸、病毒等生命大分子。硅胶：含硅醇基团（-Si-OH），氨基酸、甾体激素、皂苷类、类脂和色素等等。（分离并洗脱）薄层层析：（只分离不洗脱），例如：硅胶薄层层析和聚酰胺薄膜薄层层析硅胶薄层层析：•硅胶板分类（4类），硅胶H（纯硅胶），能用腐蚀性强的显色剂；硅胶G（10%-15%煅石膏和5%淀粉的硅胶）；硅胶CMC（含羧甲基纤维素）；硅胶HF254(含荧光剂的硅胶H)。•硅胶板的制备：玻璃板，硅胶制备（加溶剂碾磨），铺板，活化和合格检查：约1mg苏丹黄、苏丹红和靛酚蓝混合物乙酸乙酯溶液点样，苯：展层剂，Rf：苏丹黄苏丹红靛酚蓝，苏丹黄Rf约0.5，苏丹红和靛酚蓝Rf之差在0.1—0.2。•分析程序：点样，展层，显色。聚酰胺薄膜薄层层析：•如：DNS—氨基酸分析，DNS-Cl（二甲氨基萘磺酰氯），灵敏度10-9—10-10mol/L。•DNS-Cl和氨基酸或多肽在特定条件下反应。•DABTH-氨基酸的薄层层析分析蛋白质序列。•Edman降解试剂DABITC（4-N,N-二甲氨基偶氮苯-4’-异硫氰酸酯）进行微量蛋白质序列分析（2—10nmol肽样品）。单向纸层析•双向纸层析•薄层层析硅胶G板薄层层析2、凝胶色谱：凝胶过滤、排阻色谱或分子筛层析以具有筛孔的介质为固定相，依据分子大小进行物质分离的液相色谱技术。原理：•分子在固相筛孔中自由扩散、渗透，•不同尺寸的分子在筛孔中的分配系数不同，导致分子流动速度不同。•流动相流动过程中，物质在凝胶内和凝胶外很快达到分配平衡。•分子量大，排阻大，分子量小，排阻小，物质按分子量的大小流出分离柱。•分子排阻范围为：0~100%。（排阻率为0和100的物质不能分离。Why？）如何理解？凝胶色谱示意图0100200020406080elutionvolume/mlAbsorbance/mAUUV280LH3LH2分配系数（Kav）：分离组分在凝胶内水和外水体积中的比例关系。Kav=(Ve-V0)/ViVt=Vo+Vi+Vg，Vt、Vo、Vi和Vg分别为：床体积、外水体积、内水体积和介质的体积。Ve：分离组分流出的体积。分离物质的大小，0Kav1，Kav=0或Kav=1，不能分离。凝胶种类和性质：种类：浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等：常用种类和商品名称（根据分类对象选择凝胶材料）交联葡聚糖（SephadexG10—G200）；AmershamBiosciences交联琼脂糖（SepharoseCL-4B,CL-6B）SephacrylS系列（聚丙烯酰胺-葡聚糖）Superdes系列（高交联琼脂糖-葡聚糖）Bio-BeadsS-X系列（苯乙烯-二乙烯苯）Bio-GelP系列（聚丙烯酰胺）Bio-RadBio-GelA系列（琼脂糖）TSKgelSW系列（硅胶）TSKgelToyopearlHW系列，亲水性聚乙烯醇ToyoSodaTSKgelPW系列亲水性聚乙烯TSKgelCW-35纤维素Cellulofine纤维素Chisso操作程序：凝胶选择和处理（型号和粒度、凝胶用量、凝胶处理）凝胶柱的制备（柱选择：径长比约为：1:25—1:100，装柱、柱鉴定）平衡层析柱加样和洗脱（加样、洗脱、样品收集，检测）凝胶柱的再生和保存应用：分离纯化、脱盐和浓缩、去热源物质分析检测（定性、定量、分子量）。Kav=-blgMr+c（3）离子交换色谱：理解：依据电荷大小进行物质分离的液相色谱技术。原理：固相介质上结合有一定的离子基团。结合阳离子基团，称阴离子交换剂，其反离子为阴离子（如：Cl-）。在适当的条件下，反离子与分离物中的阴离子交换。在不同盐浓度或pH值下，将带不同电荷的物质洗脱下来。洗脱方式：洗脱剂分类：盐梯度洗脱；pH梯度洗脱。洗脱梯度分类：连续梯度；不连续梯度。01503000100200300UV280CNaclConcentrationofNacl/10-3mol*l-1Absorbanceat280nm/mAUelutionvolume/ml50%sampleRC-LH1LH20150300020离子交换剂分类（2种）交换剂分类I（根据交换剂所带电荷：2大类）阳离子交换剂：交联阴离子基团，与阳离子交换。如：羧甲基（-O-CH2-COO-）阴离子交换剂：交联阳离子基团，与阴离子交换。如：氨基乙基（-O(CH2)2-NH3+）交换剂分类II（根据基质的组成和性质：2大类）疏水性离子交换剂（亲水性较小的合成树脂，如苯乙烯与二乙烯苯的聚合物）–阳离子交换剂—带负电荷，电荷强弱（强酸型、中强型和弱酸型），反离子为正电荷离子–阴离子交换剂—带正电荷，电荷强弱（强阴性、中阴性和弱阴性），反离子为负电荷离子–螯合离子交换剂—具有络合一些金属离子、排斥另外一些离子的能力，选择性更高亲水性离子交换剂（亲水性较大的合成物质，纤维素、葡聚糖、交联琼脂糖等）–阳离子交换剂–阴离子交换剂常用固定相介质–DEAE（二乙基胺基乙基）—CelluloseDE-32–DEAE—CelluloseDE-52–DEAE-SephadexA-50（25）–DEAE-SepharosCL-6b–DEAE-Bio-GelA–CM（羧甲基）-CelluloseDE-52–CM-Cellulose–CM-SephadexC-25(50)离子交换剂的选择依据–物质在溶液中的电荷性质–物质的吸附特性（疏水、亲水）–实践和经验蛋白质分离离子交换色谱操作程序洗脱方式：梯度洗脱——连续梯度和非连续梯度洗脱应用：物质分离、测定等电点（PI）凝胶预处理装住平衡上样洗脱再生（4）亲和层析利用分子间特异性可逆结合对物质进行特异性分离的液相色谱技术。原理：具有特异性亲和力的两个分子中，一个固定在不溶性的基质上，对另一个分子进行分离。（次级作用力相互作用的分子）固定在基质上的分子称配体，共价键与基质相连，构成固定相。流动相中的分子被特异性地与固定相吸附，使物质彼此分离。如：酶—抑制剂、抗原—抗体、A蛋白—Ag、配体—配基、过渡金属离子（Cu、Ni、Zn、Co等）与O、S、N等供电子基团形成配位键，可与蛋白质表面组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基、