CliniMACS临床

CliniMACSplus免疫磁性分选技术在干细胞移植中的应用德国美天旎生物技术公司•1997.12欧共体批准上市•分选效率极高:纯度95%,回收率85%,•无交叉污染•传染性血制品尤为安全(完全密闭的分选系统)•目前全球已做数千例分选MACS技术•1.磁珠:超顺磁葡聚糖微球胶状基质(d50nm)特异性的鼠抗人单克隆抗体共价结合在磁珠上直接和间接的标记系统MACS技术•2.分选柱:铁磁基质高强磁场梯度吸附有磁性的阳性细胞直径0.3mm柱基质外包被生物相容性膜以防铁磁基质被缓冲液溶解MACS技术3.永久磁铁:产生比常规几何图形强10,000倍的磁场快速磁化及消磁磁珠标记原理（直接标记）磁珠标记原理（间接标记）一抗二抗MACS分选原理•MACS磁珠标记细胞•混和细胞通过分选柱•消磁•阳性细胞洗脱去除成分富集成分影响细胞活性的因素•1.细胞的储存:室温(19~25C)勿搅动细胞浓度2x108/ml储存时间24hr避免泡沫形成MACS技术－从实验室到临床研究用产品cGMP指导下生产CE认证的产品（CliniMACS）性能标准•有活性的细胞•高性能•密闭、无菌系统•样本处理极为安全•标准化的、可控的、可靠的分选过程•易于操作ClinicalCD133+cellseparation•1.升级软件•2.临床及实验室均适用•3.多种细胞的富集及去除程序•4.多种管道系统及试剂CliniMACSplus仪器CliniMACSplus分选程序富集1.1:高抗原表达及表达5%的细胞(如.CD14,CD56,CD8，可分段上样)富集2.1:低抗原表达的细胞(如.AC133)富集3.1:中度抗原表达的细胞(如.CD34)富集5.1:携带弱表达抗原的细胞(如.CD14,CD8，仅限研究用，可分段上样)CliniMACSplus分选程序阴性分选：净化1.2:常规净化－CD3,CD19（可标记12x109CD3、CD19细胞）净化2.1:超强净化－CD3,CD19（可标记20x109CD3、CD19细胞）均为分段上样程序CliniMACS构造•1.全自动细胞分选仪永久磁铁内部计算机系统挤压阀蠕动泵CliniMACS构造•2.无菌管道系统:一次性使用滴流管避免气体激活液体感受器预选柱机械性过滤非特异性的细胞分选柱CliniMACS管道系统•CliniMACSTS:60x109（5min/ml)•CliniMACSLSTS:120x109（10min/ml)•DTS:120x109(标记40x109)用于CD3/CD19去除分选，快速（2.40版）•CliniMACSTS600：20x109•CliniMACSTS150:10x109研究用CliniMACS管道DTSTSLS分选程序Depletion3.1Depletion2.1标记细胞数40x109from120x109TNC20x109from120x109TNC标记20x109处理时间1.25hr5hr标记40x109处理时间2hr10hr,分2步CliniMACS构造•3.CliniMACS试剂（CE认证）:CliniMACSCD34试剂CliniMACSCD133试剂CliniMACSCD14试剂CliniMACSCD56试剂CliniMACSCD3/CD19试剂CliniMACS抗生物素试剂细胞分选步骤总结Ph2白细胞采集物血浆稀释及体积调整抗体孵育准备CliniMACS仪器洗涤多余的抗体CliniMACSplus富集或去除收集靶细胞时间[min]总时间2－5hrs45－10030－6015－3045（检测细胞数、细胞活性）(离心15min,300g)（检测总细胞数、细胞纯度、活性）临床应用•1.造血系统恶性肿瘤、实体瘤•2.自身免疫性疾病•3.心肌缺血性疾病（心梗、心肌病）•4.病毒感染（AIDS、病毒性肝炎等）•5.遗传、代谢性疾病CliniMACSCD34试剂•阳性分选CD34＋干细胞•一支试剂最多标记6x108CD34+细胞•应用：造血系统恶性肿瘤（自体、异体移植）自身免疫性疾病实体瘤遗传、代谢性疾病CliniMACSCD133试剂•阳性分选CD133＋干细胞•一支试剂最多标记6x108CD133+细胞•应用：•1.造血系统方面：自体、异体干细胞移植（同CD34）•2.非造血系统方面（再生医疗）：表达在不同组织，具有分化为多种细胞的潜能（内皮、神经、肝细胞等），尤其是缺血性心脏病的治疗CD133分选在心外科的应用Duesseldorf,Germany(Klein)•I期临床试验心梗后病人左室容积和EF明显改善左室TMLR+CD133治疗后，缺血性心衰(心脏泵功能减弱)患者射血分数增加为原来的2倍心肌收缩功能明显增强•II期临床：随机、对照、前瞻性研究(21个患者术后LV功能：CABG+CD133+组优于单纯CABG组研究还在进行中CABG+TMLR+CD133+细胞激光打孔：心肌内CD133+干细胞注射CABG+TMLR+CD133+干细胞临床数据(TTE)：TMLR激光打孔接受心肌内CD133+干细胞注射(小规模研究)Pat.Pre-opEF%Post-opEF%Pre-opLVEDDmmPost-opLVEDDmm123446642215376242324476440426426044528455843620406240Kleinetal.HeartSurgeryForum(2004)andProceedingsofCTT2004CABG+TMLR+CD133+干细胞干细胞处理OperatingroomI决定CD133+细胞灌注骨髓采集收集、洗涤孵育、洗涤CliniMACS®分选阳性成分处理CD133+细胞准备用于手术胸阔切开术移植物收集ECC心肌再灌注心肌内CD133干细胞注射180min240min90min60min0min外科手术OperatingroomII手术干细胞操作流程Ghodsizadetal.Cytotherapy(2004)Ghodsizadetal.Cytotherapy(2004)骨髓CD133＋细胞的分选特性PatNo.BM(mL)回收率(%)纯度(%)活性(%)CD133+细胞(106)124026.690959.2220015.797977.536036.297971.9422043.495999.7522030.488788.0633014.099904.8722041.090909.183002770906CliniMACSCD14试剂•阳性富集CD14＋单核细胞，后续培养DCs•一支试剂标记4x109CD14+细胞•临床应用：1）恶性实体瘤（黑色素瘤、肾癌）2）造血系统恶性肿瘤3）病毒感染（HIV、HCV、EBV）4）自身免疫性疾病5）真菌感染单核细胞来源的DCsCD15-PE富集前23%CD15-PE富集后99%CD14+单核细胞分选DC的种类•单核细胞来源的DCs-MoDC(CD14)PBMCs中的频度5－10％•髓血细胞来源的DCs–mDC1(BDCA-1)PBMCs中的频度0.29％(0.09-0.42%)•类浆细胞来源的DCs–pDC(BDCA-4)PBMCs中的频度0.29％(0.09-0.37%)治疗性DC疫苗的种类•1）单纯DC•2）单纯被激活的DC•3）链接了特异性多肽或蛋白的DC•4）转染细胞因子、肿瘤抗原或共同刺激分子的DCCD14+单核细胞不成熟DC成熟DC血、组织淋巴组织肿瘤抗原聚集抗原递呈12DC的成熟过程治疗性DC疫苗的制备•DC前体细胞(CD14单核细胞）早期分化不成熟DC成熟分化递呈抗原的成熟DCDC疫苗注射入人体（病人）采集外周血单核细胞CliniMACSCD14分选收集纯化的CD14单核细胞细胞因子刺激培养欧洲医院的分选数据Group&YearNPurityYieldOverallDCYieldDCnumber/LPCurtietal.&200410MMpatients95.5%67.9%24.5%2.89x108Felzmannetal.&20039hd97%8%4%n.a.Mottaetal.&200312MMpatients93.8%64.4%28.6%5.7x108Sorgetal.&20033solidtumor94.3%67%14%4.7x108Meyer-Wentrup&20034buffycoats98%41%19%(buffy)Padleyetal.&20014CML&6hd94%98%71%27.3%30.3%1.9x108Summa:48donors95.7%54.1%21.5%3.7x10827/47FW03/05CliniMACSCD56试剂•CD56Ag表达在NK细胞和CD3＋T（NKT）细胞亚群表面•NK细胞作用：体内一线抗感染、抗肿瘤免疫反应•刺激和抑制性受体（NCR、KIR,etc.)间的平衡和靶细胞上配体的表达状况决定了免疫反应的类型和程度Missingself机制靶细胞溶解ADCC•NK细胞与GVL效应有关CD56试剂的临床应用•1.造血系统恶性肿瘤（AML,CML,etc.)的半相和移植后NK－DLI（纯化的CD56＋细胞在体外经IL－2激活后分次回输）防止复发降低GVHD（CD3－CD56＋分选）降低排斥率CD56试剂的临床应用•2.恶性实体瘤的免疫治疗：主动免疫治疗被动免疫治疗非特异性：免疫佐剂特异性：肿瘤抗原疫苗抗体：mAb,multiclonalAb(ADCC作用）细胞：TIL，LAK，CIK，etc.间接作用：阻断因子（如：生长因子或血管生成素因子的抑制）CliniMACSCD3/CD19试剂•标记细胞数：CD3：15x109from40x109TNCCD19:5x109from40x109TNC•分选程序的选择：DEPLETION2.1:Version2.31以上(TSLS)DEPLETION3.1:Version2.40(DTS)CD3/CD19分选的临床应用•异基因移植：CD3去除：降低GVHDCD19去除：降低PTLD同时保留NK、DC及其它效应细胞动员方案可适当减弱CliniMACS分选比较CD34CD133CD3/CD19移植物成分SCSCSC、NK、M、DCT细胞去除（Log）4.6-5.13.8-4.23.0-4.1B细胞去除（Log）3.2-3.73.12.2-3.7*以上数据综合了欧洲不同实验室的结果