抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研

书书书抗真菌和抗除草剂基因多价植物表达载体构建及对烟草遗传转化的研究贾小霞１，张金文１，王汉宁１，马怀义１，梁慧光２（１．甘肃农业大学农学院，甘肃兰州７３００７０；２．甘肃农业大学理学院，甘肃兰州７３００７０）摘要：利用基因重组技术，将木霉几丁质酶基因（Ｃｈｉ）和β１，３葡聚糖酶基因（Ｇｌｕ）进行融合并将其引入含ｂａｒ基因的载体ｐＡＨＣ２５中，成功构建了由Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ启动子分别驱动ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ和ｂａｒ的中间载体，然后将其上的ＵｂｉＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕｎｏｓ和Ｕｂｉｂａｒｎｏｓ表达盒引入ｐＢＩ１２１中，获得兼具除草剂抗性基因ｂａｒ和真菌抗性基因Ｃｈｉ与Ｇｌｕ的三价植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ，并对烟草进行遗传转化，经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，共获得转基因烟草３２株。外源基因已整合到烟草基因组中。离体抑菌试验表明转基因烟草叶片提取液对木霉菌和镰刀菌表现出一定的抗性。关键词：融合基因；几丁质酶；β１，３葡聚糖酶；ｂａｒ基因；植物表达载体中图分类号：Ｓ５７２．０３２　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００４５７５９（２００９）０１００８６０８　几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ，Ｃｈｉ）和葡聚糖酶（β１，３ｇｌｕｃａｎａｓｅ，Ｇｌｕ）不但可以降解病原菌细胞壁，抵消病原菌的侵染力，抑制真菌的生长增殖，而且能释放病原菌细胞壁的寡糖片段，作为宿主防御体系活化的诱导物。Ｍａｕｃｈ等［１］在体外试验时发现用Ｃｈｉ单独处理时仅能抑制木霉菌（犜狉犻犮犺狅犱犲狉犿犪ｖｉｒｉｄｅ）的生长，用Ｇｌｕ处理仅能抑制镰刀菌（犉狌狊犪狉犻狌犿狊狅犾犪狀犻犳ｓｐｐｉｓｉｉ）的生长，而２种酶共同作用时，能有效抑制８种真菌生长。几丁质酶和β１，３葡聚糖酶的酶解活性及抑菌范围虽各不相同，但具有极强的协同作用［２～６］。此外，几丁质酶活性的增强往往伴随β１，３葡聚糖酶及其他抗病蛋白（ｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＰＲ）的形成，共同发挥植物的防卫作用。因此，构建能同时表达Ｃｈｉ、Ｇｌｕ两种水解酶基因的双价植物表达载体对植物进行转化，将会增强植物的抗病性，扩大其抑菌范围［７］。以往基因转化中一般采用抗生素作为筛选标记系统。由于转化细胞对抗生素的解毒作用导致的交叉保护，高频率的未转化植株和嵌合体也通过了抗生素筛选。而ｂａｒ基因是常用的选择标记基因之一，将它与其他目的基因构建到同一载体上，选择培养基中加入一定量的除草剂就能筛选到含目的基因的转化细胞。它克服了抗生素筛选的局限性，细胞产生的假转化体很少。Ｘｕ等［８］将转化后的水稻（犗狉狔狕犪狊犪狋犻狏犪）愈伤组织，放在加有６ｍｇ／Ｌ膦化麦黄酮（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ，ＰＰＴ）的选择培养基上选择培养６周，验证了６０多株再生植株中无一假阳性出现。ｂａｒ基因除作为选择标记外，还能给作物带来抗除草剂的特性。使用与抗除草剂基因相配的除草剂，能有效除去杂草，大大减少劳动力，且能解决直播（或抛秧）田的草荒问题。于志华等［９］采用基因枪法获得了抗性转ｂａｒ基因旱稻植株，有望解决旱直播稻的田间杂草问题。１９９６年在美国进行抗除草剂Ｌｉｂｅｒｔｙ转基因水稻田间鉴定试验，转基因水稻充分表达抗除草剂的特性，能经济有效地控制包括红稻（犗．狅犳犳犻犮犻狀犪犾犻狊）在内的一切田间杂草［１０］。目前，利用几丁质酶基因和ｂａｒ基因转化玉米（犣犲犪犿犪狔狊），取得了一定进展［１１～１５］。但将几丁质酶基因、β１，３葡聚糖酶基因和除草剂抗性基因ｂａｒ同时转入玉米的研究尚未见报道。本研究将木霉几丁质酶基因和β１，３葡聚糖酶基因以融合基因的方式和ｂａｒ基因一起引入高效植物表达载体ｐＢＩ１２１中，构建了三价载体ｐＢＩｂＣＧ，并利用农杆菌介导法转化烟草（犖犻犮狅狋犻犪狀犪狋狅犫犪犮狌犿），获得了转基因植株，研究了融合基因对真菌的抗病性，８６－９３２００９年２月　　　草　业　学　报　　　　　　ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ　　　第１８卷　第１期Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１收稿日期：２００８０６１８；改回日期：２００８０９０５基金项目：国家高新技术研究发展计划（８６３计划）项目（编号：２００４ＡＡ２０７１４０）资助。作者简介：贾小霞（１９７８），女，甘肃定西人，在读博士。Ｅｍａｉｌ：[e-mail]通讯作者。Ｅｍａｉｌ：[e-mail]以为进一步用该载体转化玉米，获得抗菌谱广且具有除草剂抗性的玉米材料提供理论和实践依据。１　材料与方法１．１　材料１．１．１　菌株与质粒　大肠杆菌（犈狊犮犺犲狉犻犮犺犻犪犮狅犾犻ＤＨ５α）、根癌农杆菌（犃犵狉狅犫犪犮狋犲狉犻狌犿狋狌犿犲犳犪犮犻犲狀狊）ＥＨＡ１０５、质粒ｐＥＴ／Ｃｈｉ（含Ｃｈｉ），ｐＥＴ／Ｇｌｕ（含Ｇｌｕ）、ｐＢＩ１２１载体均由甘肃农业大学遗传育种实验室保存；质粒ｐＡＨＣ２５由南京农业大学陈佩度教授惠赠；ｐＧＥＭＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒ购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶及高保真ＤＮＡ聚合酶购自ＴａＫａＲａ公司。１．１．２　植物材料及其培养基　烟草红花大金子由本实验室保存。植物培养基：共培养培养基为ＭＳ培养基（ｍｕｒａｓｈｉｇｅａｎｄｓｋｏｏｇｍｅｄｉｕｍ，ＭＳ），筛选培养基ＭＳ１为ＭＳ＋６Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ（６ＢＡ）０．５ｍｇ／Ｌ＋头孢曲松钠（ｃｅｆｔｒｉａｘｏｎｅｓｏｄｉｕｍ，Ｃｅｆ）５００ｍｇ／Ｌ＋ＰＰＴ１０ｍｇ／Ｌ，生根培养基ＭＳ２为１／２ＭＳ＋Ｃｅｆ２５０ｍｇ／Ｌ＋ＰＰＴ１０ｍｇ／Ｌ。１．２　引物以ＧｅｎｅＢａｎｋ中Ｃｈｉ、Ｇｌｕ基因和胭脂碱合成酶（ｎｏｐａｌｉｎｅｓｙｎｔｈａｓｅ，ＮＯＳ）终止子序列为依据，采用Ｏｌｉｇｏ６．０分析软件设计各片段亚克隆的聚合酶链式反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）引物，考虑到后续载体构建和片段融合需要，在引物设计时加入酶切位点和ｌｉｎｋｅｒ，Ｃｈｉ、Ｇｌｕ基因和ＮＯＳ终止子的引物分别命名为Ｐ１、Ｐ２，Ｐ３、Ｐ４和Ｐ５、Ｐ６。其构成如下：Ｐ１：５′ＧＣＧＣＣＣＧＧＧ犛犿犪ⅠＡＴＧＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＴＣＧＧＡＡＡＡＴＣＣ３′Ｐ２：５′ＧＣＧＡＡＧＣＴＴ犖犮狅ⅠＧＧＡＴＣＣ犅犪犿犎ⅠＧＴＴＧＡＧＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＡＴＧＴＴＡＴＣ３′Ｐ３：５′ＧＣＧ犵犵犪狋犮犮犅犪犿犎Ⅰ犵犵犪狋犮狋狋犮犵犮犮犵犵犵犮狋犮犵ＣＴＣＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＡＴＣＡＣＡＣＴＣＣＴＡＧＧＡＴ３′Ｐ４：５′ＧＣＧＡＣＴＡＧＴ犛狆犲ⅠＴＣＡＣＡＴＣＴＣＡＣＴＴＡＣＧＡＧＡＧＡＡＧＣＡＧＴＡＧＣ３′Ｐ５：５′ＧＣＧＣＣＣＧＧＧ犛犿犪ⅠＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴ３′Ｐ６：５′ＧＣＧＧＡＧＣＴＣ犛犪犮ⅠＡＣＴＡＧＴ犛狆犲ⅠＧＡＡＴＴＣＣＣＧＡＴＣＴＡＧＴＡＡＣＡ３′下划线部分为酶切位点碱基组成，上标为相应的内切酶，小写部分为ｌｉｎｋｅｒ序列。１．３　ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ融合基因及ＮＯＳ序列的获得１．３．１　ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ融合基因的获得　分别以ｐＥＴ／Ｃｈｉ，ｐＥＴ／Ｇｌｕ为模板，以Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４为引物，按以下参数扩增Ｃｈｉ基因和ｌｉｎｋｅｒ＋Ｇｌｕ。Ｃｈｉ：９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，６５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环３０次后７２℃继续延伸１０ｍｉｎ；ｌｉｎｋｅｒ＋Ｇｌｕ：５７℃退火４５ｓ，其余参数同Ｃｈｉ。扩增产物电泳鉴定，回收目的片段与Ｔ载体连接、转化、鉴定及测序，将正确的重组子命名为ｐＧＥＭＧｌｕ和ｐＧＥＭＣｈｉ。将质粒ｐＧＥＭＧｌｕ用犖犮狅Ⅰ／犅犪犿犎Ⅰ切开，与经同样酶从ｐＧＥＭＣｈｉ上切下的Ｃｈｉ片段连接、转化、筛选，对获得的重组子进行ＰＣＲ及酶切鉴定后测序，将正确的重组子命名为ｐＧＥＭＣＬＧ。１．３．２　ＮＯＳ序列的获得　以ｐＢＩ１２１为模板，以Ｐ５和Ｐ６为引物扩增ＮＯＳ终止子，反应参数为：９５℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性１ｍｉｎ，６５℃退火１ｍｉｎ，７２℃延伸２ｍｉｎ，循环３０次后，７２℃继续延伸１０ｍｉｎ。扩增产物经电泳鉴定，回收目的片段并与Ｔ载体连接、转化，经ＰＣＲ、酶切鉴定后所得重组质粒命名为ｐＧＥＭＮＯＳ。１．４　植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ的构建植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ的构建过程如图１，并按照该过程进行。１．４．１　中间载体ｐＢＩ１２１ｂａｒ的构建　用犈犮狅犚Ⅰ／犎犻狀犱Ⅲ消化中间载体ｐＡＨＣ２５，回收Ｕｂｉ启动子驱动的ｂａｒ基因表达盒并与经同样酶切并回收的植物表达载体ｐＢＩ１２１大片段相连、转化，经ＰＣＲ及酶切验证后，所得正确重组子命名为ｐＢＩ１２１ｂａｒ。１．４．２　中间载体ｐＡＨＣ２５ＣＧ的构建　用犛犿犪Ⅰ／犛犪犮Ⅰ对ｐＧＥＭＮＯＳ进行酶切，并回收ＮＯＳ小片段与经同样酶切回收的ｐＡＨＣ２５载体大片段相连，转化得重组质粒ｐＡＨＣ２５ＮＯＳ。用犛犿犪Ⅰ／犛狆犲Ⅰ双酶切ｐＡＨＣ２５ＮＯＳ，回收大片段与经同样酶切ｐＧＥＭＣＬＧ后回收的ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ小片段相连，转化得重组质粒ｐＡＨＣ２５ＣＧ。７８第１８卷第１期草业学报２００９年图１　植物表达载体狆犅犐犫犆犌构建流程犉犻犵．１　犘狉狅犮犲犱狌狉犲狅犳狋犺犲犮狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀狅犳狆犾犪狀狋犲狓狆狉犲狊狊犻狅狀狏犲犮狋狅狉１．４．３　植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ的构建　用犎犻狀犱Ⅲ单酶切ｐＢＩ１２１ｂａｒ，经碱性磷酸化酶去磷酸化后，将线性质粒载体在Ｔ４ＤＮＡ连接酶的作用下与经同样酶切ｐＡＨＣ２５ＣＧ后回收的小片段相连，转化得三价植物表达载体ｐＢＩｂＣＧ。１．５　烟草的遗传转化及其分子检测１．５．１　根癌农杆菌转化　载体ｐＢＩｂＣＧ向根癌农杆菌ＥＨＡ１０５的直接转化参照文献［１６］。１．５．２　烟草外植体的转化及植株再生　采用叶盘法进行转化［１７］。将烟草无菌苗健壮叶片切割成０．５ｃｍ２的小块，浸入参照文献［１８］制备的农杆菌菌液中，浸染５～１０ｍｉｎ。取出叶盘后，用无菌滤纸吸干菌液，将叶盘背光面朝下平放在ＭＳ培养基上，置于２５℃左右暗培养。３ｄ后转移至ＭＳ１培养基，于２５℃左右１４ｈ光照培养。约２周后，切下带芽的叶缘插入ＭＳ１中进行筛选培养。４周后，切下幼芽插入ＭＳ２培养基中于２５℃左右１４ｈ光照条件下诱导生根，获得转基因植株。８８ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２００９）Ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１１．５．３　转基因烟草的ＰＣＲ检测及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析　参照杨锦芬等［１９］的方法，用十六烷基三乙基溴化铵（ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｌ／ｌｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ，ＣＴＡＢ）法提取转基因烟草植株及未转基因对照烟草的叶片总ＤＮＡ，以Ｐ１和Ｐ４为引物进行ＰＣＲ检测。将ＰＣＲ阳性植株的ＤＮＡ用犛狆犲Ⅰ／犛狊狋Ⅱ双酶切后，以Ｃｈｉ１．３ｋｂ片段为探针，按照由Ｒｏｃｈｅ公司生产的ＤＩＧＬａｂｅｉｌｉｎｇ试剂盒说明进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析。１．６　转基因植株的抑菌试验采用琼脂糖孔穴扩散法［２０］，分别取非转化植株和ＰＣＲ检测为阳性的植株（１和６号）幼叶于无菌研钵中捣碎，按照１ｇ／ｍＬ加入无菌磷酸钠缓冲液（ｐＨ值６．４），研成匀浆。将匀浆转入无菌离心管中，４℃抽提过夜，１００００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心２０ｍｉｎ，取上清液供测试用。将木霉菌和镰刀菌分别接种于马铃薯培养基平板上，２８℃培养至菌丝萌发。用无菌枪头分别在菌丝处和空白马铃薯培养基平板圆心位置打孔，取出空白琼脂块，将有菌丝的琼脂块填入其中，２８℃培养至菌丝直径约为３ｃｍ。再在接种孔左右两边打孔，取出琼脂块，分别加入阴性对照和待测样品２００μＬ，２８℃温箱内培养，２４～３６ｈ后观察抑菌结果。２　结果与分析２．１　ＣｈｉｌｉｎｋｅｒＧｌｕ基因融合及测序分别以Ｐ１、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４为引物，以ｐＥＴ／Ｃｈｉ和ｐＥＴ／Ｇｌｕ为模板扩增，ＰＣＲ产物经电泳检测，结果显示，分别扩增出约１．３和１．１ｋｂ的特异带，与预期的Ｃｈｉ和Ｇｌｕ基因大小相