95功能性红曲研究进展

ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ功能性红曲研究进展(2)红曲的生产工艺及MonacolinK和桔霉素的检测鲁佳慧刘昕王江海袁建平(中山大学国家教育部食品工程研究中心广州510275)摘要综述红曲的生产工艺及MonacolinK和桔霉素的检测方法，指出采用新型生产工艺、优化发酵条件和应用菌种筛选等现代技术是生产既富含活性成分MonacolinK又不含桔霉素的功能性红曲的重要途径，同时预示MonacolinK和桔霉素的检测技术的进展将为功能性红曲的产品质量、安全使用及国际市场的开拓提供技术支撑。关键词红曲生产工艺MonacolinK桔霉素检测红曲是我国的传统发酵产品，长期应用于食品着色及作为药用。1979年以来，日本远藤章从红曲发酵液中发现并分离得到了一系列可显著抑制体内胆固醇合成的活性物质Monacolin类化合物，其中以MonacolinK的活性最为显著。药理学研究和临床试验表明红曲能有效降低体内总胆固醇以及甘油三酯、低密度脂蛋白水平，同时升高高密度脂蛋白水平，从而具有显著的降胆固醇及降血脂的作用[1~2]。红曲中Monacolin类化合物的发现使红曲被作为天然药物中抑制胆固醇合成和降血脂的首选药物，并受到世人瞩目。然而，真菌毒素桔霉素(Citrinin)的发现使功能性红曲的使用安全性受到了挑战。桔霉素是红曲菌的一种次级代谢产物，具有肾毒性，还可致畸、致癌和诱发基因突变[3]。桔霉素的存在已成为我国功能性红曲应用和出口的瓶颈。因此，采用新型生产工艺、优化发酵条件、应用菌种筛选等现代技术，研发富含MonacolinK活性物质且不含桔霉素的功能性红曲必将成为生产功能性红曲技术革命的制高点。1功能性红曲的生产工艺1.1固态发酵传统红曲生产工艺主要是以大米为固态培养基，接种红曲菌菌种后发酵生产红曲。该方法工艺落后，劳动强度大，红曲产量低，质量不稳定，并且易受杂菌污染。80年代后，通风池法应用于红曲的生产，红曲产量和质量相对提高。圆盘制曲机的应用实现了红曲的自动化生产，并提高了红曲质量，在一定程度上减少了杂菌污染。但该设备投资较大，适合大型红曲生产企业应用。传统红曲发酵工艺由于未能有效控制通风、温度、湿度等重要发酵条件，因此，所得红曲的色价和活性成分较低，且桔霉素污染严重。有学者[4]提出固态发酵中，在红曲菌菌丝体生长后期，代谢产物MonacolinK的积累达到最大。同时，由于淀粉质固态培养基料被红曲菌分泌的淀粉酶和糖化酶液化而出现基料通气环境恶化，菌丝体细胞壁被高渗透压葡萄糖液浸润，从而使其生长代谢出现变态反应，促使了桔霉素生成以抑制其它杂菌的生长。因此，现代固态发酵工艺的关键是控制发酵过程中菌种质量及物料含水量、通风量、培养温度及湿度等参数，从而有效提高红曲中MonacolinK的含量并抑制桔霉素的生成。刘昕[4]提出了一种通过调控红曲菌培养过程中的培养温度、湿度及通风量来抑制桔霉素生成的方法，所获得的功能性红曲中MonacolinK含量高且未检测出桔霉素。ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ王立新[5]等经研究认为，固态发酵较液体发酵具有明显的优势。在确立的实验条件下，固态发酵的MonacolinK产率为液体发酵的20倍以上。因此在掌握固态发酵的规律基础上，设计合理的固态发酵反应系统，实现高效低耗的固态发酵生产，是功能性红曲产业化生产的有效途径。同时，该研究表明固态发酵过程中物料的初始含水量以50%为宜。含水量较高时，糖化酶活性增强，从而加快培养基料的糖化速率，不利于红曲中MonacolinK的积累。培养温度对促进红曲菌发酵过程中MonacolinK的生成十分重要。恒温培养可获得比变温培养更高收率的菌体量和色素，而变温培养的MonacolinK产量更高。实验研究表明，在32C温度下培养9d后，将温度降至25C下培养14d，则更有利于MonacolinK的积累[6]。红曲为好气性菌，其菌丝体的生长和MonacolinK等次级代谢产物的产生都需要有足够的氧气。因此，适宜的溶解氧水平是一个非常重要的参数，它直接影响红曲中MonacolinK和桔霉素的含量。提高通风量有利于菌体生成和MonacolinK的产生，但同时桔霉素的含量也增加。因此，在满足溶氧需求的情况下，可采用低通风量[7]。固态发酵法是目前红曲生产中广泛使用的方法，较液态发酵相比，固态发酵生产红曲具有投资少，产量大，生产经验丰富等优点，通过现代先进技术优化和改造发酵工艺，可望有效生产富含活性成分MonacolinK且不含桔霉素的功能性红曲。1.2液态发酵液态发酵红曲主要用淀粉、葡萄糖、甘油、黄豆粉、玉米浆和蛋白胨等培养基，采用常规标准深层发酵设备，如机械搅拌发酵罐等。近年来开发的适宜于高粘度发酵体系的气升式反应器，将更加有利于发酵过程的进行。液态培养基的碳源、氮源、初始pH值及溶氧量等是关键的工艺控制参数。碳源以甘油最好，葡萄糖次之。有机氮源中肉膏和蛋白胨优于酵母膏，无机氮源则以NaNO3较好。C/N比值是十分重要的控制因素，它不仅影响前期菌丝体的生长，而且对后期代谢产物的形成和积累也非常重要。实验结果表明，当C/N比为5:33时，MonacolinK的产量较高[8]。赵树欣[7]等认为培养基的初始pH值对MonacolinK的生成也有明显影响，当pH为6.0~6.5时最为适宜。许赣荣[9]等对筛选的一株低产桔霉素红曲菌菌种进行液态培养，选用玉米淀粉和谷氨酸单钠盐为主要成分的培养液，所获得红曲菌发酵液中桔霉素浓度低于1mg/ml。此外，溶氧条件对红曲菌产桔霉素的影响的研究表明，高溶氧对桔霉素的产生有促进作用。Blanc[10]等研究发现，在液态深层培养红曲过程中添加6碳至18碳的脂肪酸和甲基酮会影响红曲中桔霉素的生成，尤其是辛酸和2-三十碳酮可使桔霉素的生成量减少75%。杨胜利[11]等研究发现，应用超声波可提高红曲菌发酵过程中MonacolinK的产量。正常情况下红曲菌落呈团状，氧和营养物质不易于吸收，也不利于代谢产物的生成。采用超声波处理可使菌丝体分散，甚至成为游离的单菌体，从而有利于菌体的代谢和活性物质的分泌。同时，超声波处理还可降低发酵液粘度，有利于氧气和营养物质的传递。实验结果显示，当超声处理时间为2min左右时其效果最佳，既不引起细胞死亡，又能显著提高MonacolinK的产量。采用液态发酵，基质的混合和扩散较为均匀，利于氧气和其它营养成分的传递扩散，且易于添加某些特定成分以抑制桔霉素的生成。但目前国内采用液态深层发酵法生产的红曲发酵液中，MonacolinK含量较低且不稳定，甚至出现添加由土霉素发酵获得的MonacolinK或合成药洛伐他汀来控制产量的现象。因此，红曲的液态发酵工艺及产品质量控制需进一步加以规范。1.3菌种筛选ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ通过菌种诱变筛选出特异性菌种是提高红曲中MonacolinK的含量并抑制桔霉素生成的另一重要途径。魏培莲[12]等对红曲菌出发菌株(Parentstrain)进行紫外线、硫酸二乙酯、氯化锂等诱变剂反复诱变处理后，获得3株具有较强MonacolinK生产能力的菌株，其中一株的MonacolinK产量与出发菌株相比提高了41倍。采用Nd:YAG激光对红曲菌出发菌株进行诱变处理，筛选出一菌株，其淀粉液化酶活力和产色素能力下降，但MonacolinK产量大幅提高，为降脂红曲的菌种优化指明了方向[13]。许赣荣[14]等对不同的红曲菌菌种进行统一的液态培养和固态发酵，并对所得到的液态发酵液和固态发酵红曲米的色价和桔霉素含量进行了测定，得到了高色价低产桔霉素的红曲菌菌种，经鉴定为紫色红曲菌。1.4基因工程技术的应用提高红曲中MonacolinK的含量并控制桔霉素产生的主要途径是优化发酵工艺和菌种筛选，利用基因工程技术改造红曲菌菌种可望从根本上解决桔霉素生成的问题。通过对红曲色素、Monacolin类化合物和桔霉素的生物合成途径研究，发现这三类物质都是聚酮体化合物，由聚酮体合成酶(PKSs)合成。目前，在某些真菌的PKSs研究领域已有很好的基础理论研究，如土曲霉中与MonacolinK合成有关的PKS基因族已被发现[15]。由于红曲菌中的3类主要次级代谢产物都是PKSs基因家族的产物，故研究红曲菌PKSs基因的结构和功能可能是今后筛选高产MonacolinK且不产桔霉素的红曲菌菌种以及调控红曲菌代谢产物生成的关键。2MonacolinK及桔霉素的检测2.1MonacolinK的检测MonacolinK的测定方法主要有紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相法(HPLC法)、超临界流体色谱法等，其中最常用的是以C18柱作为分离柱，联合紫外检测，采用乙腈或甲醇和磷酸水溶液为流动相的HPLC检测方法。红曲中的MonacolinK以两种形式同时存在，即闭环的内酯式结构和开环的酸式结构。随着红曲生产加工过程中干燥程度的逐渐增加，酸式结构的MonacolinK逐渐脱水向内酯式结构转化，因此，生产加工工艺不同，产品中两种结构成分的含量也不尽相同。目前，红曲中MonacolinK的HPLC检测方法多采用美国药典中土曲霉内酯式洛伐它汀的检测方法，事实上仅适用于检测红曲中的内酯式MonacolinK。罗仁才[16]等用NaOH将红曲样品碱化处理，使内酯式MonacolinK全部转化为酸式，以HPLC法测定了红曲中MonacolinK的总量。但上述方法都忽略了红曲中两种结构的MonacolinK的含量和比例，因此不能真正体现功能性红曲的产品质量。目前，功能性红曲产品的质量参差不齐，一些不法厂商甚至采用掺入洛伐它汀的方法造假，目前仍未有国家标准可检测红曲中两种结构的MonacolinK的含量。许赣荣[17]等将红曲样品的pH控制在6~7之间，使两种结构的MonacolinK在测定过程中不互相转化，然后用文献报道的色谱条件分别测定了红曲中内酯式和酸式MonacolinK的含量，该方法对于天然功能性红曲的鉴别和质量评价具有重要意义。2.2桔霉素的检测目前红曲中桔霉素的检测方法主要有HPLC结合紫外检测法、HPLC法结合荧光检测法、酶免疫法等。紫外检测的最低检测浓度通常为1mg/ml，而荧光检测的最低检测限可达0.60ng，更适于功能性红曲中微量的桔霉素的测定。酶免疫法测定桔霉素灵敏度亦较高，但所需试剂价格昂贵，未能普及应用。样品预处理对于减少色素在桔霉素测定中的干扰亦很重要。许赣荣[18]等经研究认为，以甲苯－乙酸乙酯－甲酸7:3:1为提取溶剂，将红曲样品超声波提取3次后，桔霉素的提取效率最高，同时提ｓｕｎｓｈｉｎｅｓｕｎｓｈｉｎｅ取的红曲色素最少，为准确检测功能性红曲中微量的桔霉素提供了较好的样品预处理方法。3展望红曲含有天然的HMG-CoA还原酶抑制成分，作为降胆固醇及降血脂天然药物，作用显著且无毒副作用，是现代降血脂药物研究的一个突破性进展。但是，传统工艺生产的红曲中Monacolin类化合物的含量非常低，并有真菌毒素桔霉素的存在，成为功能性红曲发展的瓶颈。因此，强化红曲菌的基础研究和红曲的生产工艺研究应从多方面入手，如通过菌种筛选、菌种诱变和基因重组等技术获得高产MonacolinK而不产桔霉素的理想菌株；深入研究红曲菌代谢产物的生物合成途径，以优化红曲发酵调控技术，从而提高活性成分MonacolinK的含量，抑制桔霉素的产生；利用限制性内切酶酶切片断长度多态性及随机扩增多态性分析技术，找出产生Monacolin类化合物等聚酮体的特定DNA片断，通过转基因技术或反义技术来提高活性成分的含量；通过填料粒径为3µm的HPLC分离柱的普及和推广应用，以提高红曲中Monacolin类化合物及桔霉素的监测和检测技术，为我国功能性红曲产品的安全使用和国际市场的开拓提供坚实的技术支撑。参考文献1.傅剑云,夏勇,孟佳.红曲对实验性高脂血症大鼠体重及血脂水平的影响[J].中国临床康复,2002,5(1):57~592.ChangL.,YanZ.,YinY.W.,etal.Monascuspurpureus-fermentedrice(redyea