烟草诱导抗病与生长调控相关基因cDNA片段的克隆-8烟

8.烟草诱导抗病与生长调控相关基因cDNA片段的克隆于海芹,卢秀萍,白永富(云南省烟草科学研究所,云南玉溪653100)摘要:用TMVN14和CMVSV52分别诱导处理NC89后，通过体细胞无性系繁殖得到两个突变体ces1-1、ces2-1，三者在抗病性和生长势上存在明显差异。在幼苗期ces2-1的长势昀强，ces1-1的长势昀弱；5-6叶期之后NC89的长势昀强，而ces2-1的长势减弱,ces1-1的长势昀弱。5-6叶期接种烟草赤星病菌(Alternariaalternata)发现，ces1-1、ces2-1的抗病性较NC89明显强，且ces2-1较ces1-1强。用差异显示PCR的方法找到了13个差异表达片段，其中R321与水稻抗稻瘟病菌相关基因有比较高的同源性，R411是烟草叶绿体基因组的一部分，R441与生长素抑制蛋白基因(APR1)在312bp的范围内同源性达88%，而R461与H2O2诱导表达的基因在130bp的范围内同源性达92%。关键词：差异显示PCR;克隆;cDNA片段中图分类号:文献标识码:CloningofTobaccocDNAInvolvedinConstitutiveExpressionofSystemicAcquiredResistanceandGrowthYuHai-qin,LuXiu-ping,BaiYong-fu(YunnanTobaccoResearchInstitute,Yuxi653100,China)Abstract:TobaccoconstitutiveexpresserofSAR1-1andces2-1mutantshavebeengeneratedfromthevarietyNC89.ThethreegenotypesvariedgreatlyingrowthandresistancetoAlternariaalternata.Theces2-1mutantgrewbetterbutess1-1grewworsethatthewildtype(WT),whereasbothmutantsweremoreresistanttothepathogen.Bothmutatedlocishowedtobedominantinheredity.WesupposethatCES1genepositivelyregulatesSARbutnegativelyregulatesgrowth,whileCES2positivelyregulatesbothSARandgrowth.TodeterminegenesthatareassociatedwithCES1andCES2functions,mRNAdifferentialdisplaywasappliedtoces1-1,ces2-1,andNC89.ThirteencDNAfragmentswereobtainedselected.ThefragmentR321showshigherhomologywiththericeblast-resistantmRNA;R411isapartoftobaccomitochondrialgenome;R441shares88%homologywiththeauxin-repressedproteingene(APR1)ina312-bpregion;andR461is92%homologicalwithoneofH2O2-inducingtobaccogenesinaregionof130bp.Keywords:DifferentialdisplayPCR;Cloning;cDNAfragments植物通过多种信号传导机制调控抗病防卫和生长发育。目前研究的比较清楚的是，水杨酸介导的系统获得抗性通路，由NPR1正向调控；乙烯介导的信号通路，乙烯在控制植物防卫和生长发育中起重要作用，而且昀新研究表明，从乙烯受体分叉到EIN2、EIN5，分别引导抗虫性和生长增强表型(董宏平，2003)。用N14和SV52分别与0.02M(pH7.2)的磷酸缓冲液等体积研磨，得到病毒汁液，分别摩擦接种5-6叶期烟苗的顶部两片嫩叶，诱导后30天，从心叶取叶碟(0.5×0.5cm),依Wernsman(1990)的方法诱导植株再生，经赤星病菌(TBA28)强毒株孢子悬浮接种后，将抗病性表现较好的一代再生植株培养至结籽，经N14诱导的NC89幼苗叶碟再生的植株获得的种子定名为constitutiveexpresserofsystemicacquiredresistance1-1(ces1-1)，经SV52诱导后得到的种子定名为ces2-1(董汉松，1995)。本研究以烟草NC89及其突变体ces1-1、ces2-1为材料，采用mRNA差异显示法克隆与诱导防卫和生长调控相关基因的cDNA片段。1材料与方法1.1材料烟草栽培品种NC89与其突变体ces1-1、ces2-1，16-25℃，自然光照生长。烟草赤星病菌(Alternariaalternate)，本实验室保存，28℃，PDA培养基上生长。1.2烟草生长和抗赤星病菌检测在不同生长期观察并测量不同品系烟草的株高，并拍照记录。将烟草赤星病菌(Alternariaalternate)放到PDA(pH5.5)平板上，28℃培养约21d后，加灭菌的1％蔗糖溶液5-10mL浸15min，用接种饵刮下孢子和菌丝体配成悬浮液，孢子含量为1.0×105/mL，菌丝体含量约为0.5g湿重/mL。离心(4000rpm,20min)，沉淀用灭菌水洗三次，昀后配成1％的蔗糖悬浮液，孢子含量调到1.0×105/mL(董汉松，1995)。用孢子悬浮法(董汉松等，1989)接种到十株烟草(8-10叶期)的第四、五真叶表面，每片叶接种12-15滴（每滴约24µl），以灭菌的1％蔗糖溶液接种作为对照，接种的幼苗先保湿(保湿箱温度为24℃左右)48h，取出后在温室(24℃)内放置约三天，观查并测量病斑直径(彭建令，2003)。1.3差异显示和片段克隆差异显示引物按Clontech的Delta®DifferentialDisplayKitUserManual设计，并由Takara公司合成(表1)。表1差异显示引物Table1Primersfordifferentialdisplay随机引物锚定引物P1:5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGGA-3'P2:5'-ATTAACCCTCACTAAATCGGTCATAG-3'P3:5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTGG-3'P4:5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGTAG-3'P5:5'-ATTAACCCTCACTAAAGATCTGACTG-3'P6:5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGGGTG-3'P7:5'-ATTAACCCTCACTAAATGCTGTATG-3'P8:5'-ATTAACCCTCACTAAATGGAGCTGG-3'P9:5'-ATTAACCCTCACTAAATGTGGCAGG-3'P10:5'-ATTAACCCTCACTAAAGCACCGTCC-3'T1:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAA-3'T2:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAC-3'T3:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTAG-3'T4:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCA-3'T5:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCC-3'T6:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTCG-3'T7:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGA-3'T8:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGC-3'T9:5'-CATTATGCTGAGTGATATCTTTTTTTTTGG-3'用Tripure试剂盒提取植物组织总RNA(杨春，2003)。用M-MLVReverseTranscriptase(Takara)合成cDNA(Rothetal.,1985;Sambrooketal.,1988)。用cDNA片段为模板进行PCR扩增，扩增程序为94℃5min，40℃5min，68℃5min，1个循环；94℃30s，40℃30s，68℃5min，2个循环；94℃20S，60℃30S，68℃2min，23个循环；68℃，延伸17min。PCR仪为9600thermalcycler（PerkinElmerCetus）。参考Clontech公司的Delta®DifferentialDisplayKitUserManual做PAGE电泳，用银染的方法检测差异条带。回收差异片段并用同一对引物再扩增，从琼脂糖胶上回收差异片段，连入Takara的pMD18-TVector验证后测序。阳性克隆用甘油(30%)保存于-70℃，备用。通过NCBI对差异片段进行序列分析。根据测序结果对感兴趣的片段合成特异性引物(表2)，并在上、下游的5’端分别加XbaI和BamHI识别碱基和GC保护碱基，从pMD18-TVector上克隆片段，然后连入沉默载体，筛选阳性克隆并初步验证基因的功能。同时，提取植物组织总RNA，用特异性引物、PromegaM-MLV试剂和高保真聚合酶ExTaqTM及厂家推荐的引物浓度(0.4µmol/L)做RT-PCR，以筛选阳性克隆，并用真核生物中高度保守、组成性表达的EF1α基因作参比。表2特异性引物序列Table2SpecificprimersforRT-PCR片段号引物序列退火温度R321R411R441R4615'-GCggatccTAACCCTCACTAAAtgg-3'5'-GCtctagaTGGCGCAAGTGCaac-3'5'-GCGGATCCTAACCCTCACTAAatgc-3'5'-GCTCTAGAgcCAATAAAGGGAACCC-3'5'-GCTCTAGACGGCATTTGGATgg-3'5'-GCGGATCCACAACTCCGTCACc-3'5'-TAGAGGACTTGGACAAAC-3'5'-GCGGATCCtcattatgctgagtg-3'59℃59℃59℃59℃57℃58℃50.3℃57℃2结果与分析2.1抗病表型差异用4-6叶期的烟草测定了NC89与其突变体ces1-1,ces2-1对真菌、细菌、病毒三种病原物的抗性。结果发现，与对照相比，ces1-1和ces2-1对细菌和病毒的抗性无明显差异。以病斑面积计算，ces1-1和ces2-1对赤星病菌的抗性较对照NC89分别提高22.14%和27.99%，实验重复三次，每一处理接种20株烟草(表3，图1)。表3不同烟草品系的抗病性和长势差异Table3InfectionofthethreetobaccogenotypesbyA.alternariaandheightof8-10-leafplants品系病斑直径(cm)减小(％)株高(cm)降低(％)NC89ces1-1ces2-10.7860.6120.56622.14%27.99%40.4527.5834.9831.82%13.52%2．2生长势差异测定了三个烟草品系在不同的生长发育阶段的长势差别。图2-2显示的是幼苗期三者的长势差别，测量8-10叶期烟草株高所得结果统计如表3。图1不同品系烟草对赤星病菌的抗性Fig.1ResponsesofthreetobaccolinestoA.alternataafterinoculationfor7days.图2幼苗期不同烟草品系的长势Fig.2Thedifferenceinthegrowthofthreetobaccolinesduringtheseedling2.3PAGE胶电泳通过差异显示PCR共找到13条比较明显的差异条带，其中包括表达量的差异和表达与否的差