切片实验方案

主要采用石蜡制片法制作永久封片，然后在光学显微镜下观察并摄影。光学显微镜用来观察材料的内部显微结构，即二维透射结构。石蜡制片法的主要步骤如下：1．取材、固定选取老嫩适中的葎草、藜、角蒿、李和连翘的茎、叶。茎，从中部截取5毫米长的小段，叶片切成4mm×6mm大小的块，放入FAA中固定，固定时间不少于48小时。FAA是由甲醛：冰乙酸：乙醇（50%）按照1：1：18的比例配制而成的复合固定剂，可以快速杀死并固定细胞，使其保持生活状态下的形态结构特征。2．脱水用乙醇作为脱水剂，经梯度浓度65%→75%→85%→95%→100%→100%逐级脱水，每个浓度梯度脱水2小时，100%乙醇时间减半，且分两次进行，第一次35分钟，第二次25分钟。因为乙醇和水互溶，所以随乙醇浓度的增大，材料中的水分逐渐被乙醇所取代。3．透明以二甲苯为透明剂，经2/3无水乙醇+1/3二甲苯→1/2无水乙醇+1/2二甲苯→1/3无水乙醇+2/3二甲苯→纯二甲苯，不断增加二甲苯的比例，逐级透明，每级透明时间为1小时。为使透明效果更好，可以用纯二甲苯透明两次，每次1小时。4．浸蜡先用低熔点的切片石蜡（52℃-54℃）在60℃下浸蜡24小时，然后用由蜂蜡（熔点58℃-60℃）和低熔点切片石蜡按1：9的质量比融合在一起的混合石蜡在温箱中60℃保温、浸蜡，每两小时换一次混合石蜡，重复进行两次，共6小时。5．包埋材料浸蜡结束后马上用镊子转移到装有液态上述混合石蜡的小纸盒中，并迅速冷却；使材料的轴性系统垂直于纸盒的底部，以便于蜡块的切修，做材料横切观察其横截面结构。镊子在使用前应先预热，以免材料粘附在镊子上损坏材料。6．切片根据材料在蜡块中的位置和方向，将蜡块修成梯形，然后粘到切片机的蜡台上进行切片。本实验采用旋转式手摇切片机，切片厚度12微米。7．展片及粘片在洁净的载玻片上均匀涂上少许蛋白甘油。蛋白甘油用鸡蛋清和甘油按1比1的体积比充分搅拌混匀制成，可以用做粘附剂。将蜡带小心地放在50℃的水面上，待蜡带展平后，用涂有蛋白甘油的载玻片将它捞起，使蜡带光面紧贴载玻片，然后在35℃温箱中烘干，蜡带就粘附在载玻片上了。8．脱蜡和染色二甲苯脱蜡后采用番红亮绿复染法染色。具体步骤如下：纯二甲苯（35℃，2-3小时）→纯二甲苯→1/2二甲苯+1/2无水乙醇→无水乙醇→无水乙醇→95%乙醇→85%乙醇→75%乙醇→65%乙醇→番红染液（24小时）→65%乙醇→75%乙醇→85%乙醇→亮绿染液（0.5-1分钟）→95%乙醇→无水乙醇→无水乙醇→1/2二甲苯+1/2无水乙醇→纯二甲苯→纯二甲苯。在从纯二甲苯到番红染液到亮绿染液再到纯二甲苯的过程中，除特殊注明以外，每个浓度梯度溶液中停留2-3分钟。9．封片及观察用中性树胶封片后，将切片放入35℃温箱中烘干。数日后可进行观察和光学显微摄影。