第二章 细胞培养设施和基本条件

第二章细胞培养设施和基本条件细胞培养技术第一节实验室设计实验室设计原则防止微生物污染和有害因素影响要求工作环境清洁、空气清新、干燥和无烟尘划分不同功能区或用铝合金板隔开无菌操作区应在室内较少走动的内侧清洗和消毒安置在另室一般包括：准备室、缓冲室和培养室准备室：用于进行培养器皿的清洗、包装、培养物质的准备和消毒以及供应物品的保藏等。缓冲室：为减少外界污染源带入培养室，在培养室外间有一缓冲室，3～5m2既可，可作为更衣室,也可放置恒温培养箱或离心机。培养室：用于进行细胞培养和各种无菌操作的实验室。其基本条件是：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线，应尽量设法避免外界的污染。培养室和缓冲室的天花板上均应装消毒用的紫外线灯。41缓冲室一、最常用的大型必备装置和仪器净化工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、离心机、冰箱、电热干燥箱、超纯水装置、消毒锅、超声波清洗器、恒温水浴箱、冷冻保存装置、天平等二、最常用的培养器具l.过滤除菌装置：不锈钢正压过滤器、一次性滤器2.手术器械3.培养器皿：溶液瓶、培养瓶、培养皿、多孔培养板、移液管和吸管、离心管第二节实验室设备外流式（基本不用）侧流式直流式超净工作台：工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。超净工作台结构和模式图CO2培养箱：维持适当温度、湿度与pH培养箱设定的条件为37℃，5％CO2培养容器需与外界保持通气状态箱内空气应保持干净，定期消毒（紫外灯、酒精）水槽:使用蒸馏水，保持一定湿度。电热干燥箱：烘干和干热消毒玻璃器皿鼓风与升温同时进行，100度时可停止鼓风禁止先升温后鼓风100度以下时再打开箱门金属器械、塑料制品、橡胶等不能在干燥箱内消毒干热灭菌（160℃，2hr）高压灭菌锅：用于湿热灭菌液体、金属器械、塑料制品、橡胶等不能在干燥箱内消毒121℃，20min超纯水仪倒置显微镜离心机液氮罐手动移液器电动移液器精密PH计微孔板震荡器培养器皿玻璃瓶皿（用于储存各种液体）玻璃瓶（500毫升、250毫升、100毫升）吸管、离心管多孔培养板4、6、24、96孔；培养皿30、60、100毫米；培养瓶第三节清洗与消毒在组织细胞培养中清洗和消毒是一项极为重要的环节。清洗的主要目的:清除杂质和微生物，使在器皿内不残留任何影响细胞生长的成份。细胞培养所用的器皿：玻璃类塑料类金属类一、清洗在细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞的生长微生物产品附带杂物上次细胞残留物非营养成分的化学物质需要清洗的培养用品玻璃器皿的清洗胶塞的清洗塑料制品的清洗1.玻璃器皿的清洗浸泡刷洗(+烘干)浸酸冲洗清洗后的玻璃器皿：干净透明无油迹浸泡：初次使用和培养使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物（灰尘或其他有害物）软化或被溶掉。先用自来水简单刷洗，然后用5％稀盐酸液浸泡过夜，以中和其中的碱性物质。再次使用的玻璃器皿则常附有大量刚使用过的残留蛋白质，干固后不易洗掉，用后立即浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上。刷洗：用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢的杂质，刷洗要适度，过度会损害器皿表面光泽度。自然晾干或烘干后泡酸。浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液（洗液）中清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉的微量杂质浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时间：一般为过夜，不应少于6小时清洁液:重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml）常用三种：强清洁液63∶1000∶200次强清洗液120∶200∶1000弱清洁液100∶100∶1000配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分。配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择玻璃制品、耐酸塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色。以配置10000ml常用清洁液为例介绍如下：先在搪瓷盆或塑料盆中加入蒸馏水8000ml，称取1000g重铬酸钾，用玻璃棒搅拌直至溶解（可加热以辅助溶解），待重铬酸钾液冷却后，缓慢加入1000ml浓硫酸，边加边用玻璃棒搅动，以混合液温度不过快上升和不出现重铬酸钾结晶为度。配好后倒入洗液缸中备用。新配制的清洁液呈棕红色。当使用时间过久，清洁液的颜色变暗、发绿或混浊时，应弃去（深埋地下），配制新的。酸缸配制、盛装清洁液的容器应防酸、耐热、有较大的开口，一般用瓷缸、玻璃制品或耐酸塑料制品。冲洗：在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗,使之尽量不留污染或清洁液的残迹。需流水冲洗十次以上，每次水须灌满及倒干净，然后用蒸馏水清洗3-5次，晾干（或烘干）备用2.胶塞的清洗新购置的瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理新胶塞置入水中浸泡后，用2%NaOH或洗衣粉煮沸10-20分钟，自来水冲洗后，蒸馏水冲洗2-3次，晾干备用。3.塑料制品的清洗塑料制品现多是采用无毒并已经特殊处理的包装，打开包装即可用，多为一次性物品。必要时用2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用5%盐酸溶液浸泡30分钟，最后用自来水和蒸馏水冲洗干净，晾干备用。新购置物品玻璃器皿清洗步骤清水浸泡半小时以上→简单刷洗→5%的稀盐酸浸泡过夜→自来水冲洗→在洗涤剂中反复刷洗→自来水中充分冲洗→凉干（或50℃烤干）→浸酸过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。用过的玻璃器皿清洗步骤带毒玻璃器材用后应立即浸入消毒水中，非带毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡→刷洗→自来水冲洗→凉干（50℃烤干）→浸酸过夜→流水振荡冲洗20遍→漓水→去离子水冲洗3～4次→三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）→50℃烤干，待包装。橡皮帽和橡皮塞的清洗新购置的橡胶制品（大小胶塞、橡皮胶头）的洗涤方法:2%NaOH煮沸15分钟→流水冲洗→2～5%稀HCl煮沸15分钟→流水冲洗→去离子水煮沸20分钟（或去离子水浸泡过夜）→去离子水冲洗一次→三蒸水煮沸20分钟→三蒸水冲洗一次→50℃烤干备用．不锈钢除菌滤器的清洗先用洗涤剂刷洗滤器→流水冲洗15分钟→去离子水冲洗2～3次（去离子水浸泡24小时）→三蒸水冲洗2～3次或浸泡24小时→干燥备用。镊子、剪刀纱布擦去脏污→自来水洗净→酒精棉球擦试。金属滤网自来水冲洗→蒸馏水冲洗→三蒸水冲洗。二、消毒细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染常见原因：操作间或周围空间的不洁培养器皿和培养液消毒不彻底由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染物理消毒灭菌法紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿。消毒时间：30min（至少）紫外杀菌功能除了紫外本身以外，还可以由产生的臭氧来完成。紫外灭菌以后，最好过一个小时再进去。湿热（高压蒸气灭菌法）：121℃，20min适用于：培养用液、橡胶制品布类、玻璃制品、金属器械等干烤：160℃,2小时（适用于玻璃器皿等）注意：消毒后不要立即打开箱门，以防止冷空气骤然进入引起玻璃炸裂，影响消毒效果。过滤：0.22μm（适用于不适合高温的液体，如蔗糖溶液，胰酶消化液）化学消毒灭菌法7５%酒精：主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理1-２‰新洁尔灭：主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒抗生素消毒灭菌法培养液中加入100单位的青霉素和链霉素，主要用于预防微生物污染1234567891011课后思考题：1.细胞培养工作室可分为那几个部分，各有什么作用?2.试述清洁液的配方组成及配制时的注意事项。3.细胞培养中需要进行物理、化学和抗生素消毒，举出消毒方法和使用范围。