第八章 色谱法概论

2020/1/18第八章色谱分析基础第一节色谱法概述一、色谱法的特点、分类和作用characteristic,classificationactuationofchromatograph二、气相色谱分离过程separationprocessofgaschromatograph三、色谱流出曲线与基本术语Chromatogramandnamewordsfundamentalofchromatographanalysisgeneralizationofchromatographanalysis2020/1/18一、色谱法的特点、分类和作用1.概述混合物最有效的分离、分析方法。俄国植物学家茨维特（Tswett)在1906年使用的装置：色谱原型装置，如图。色谱法是一种分离技术。试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。其中的一相固定不动，称为固定相；另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。尽管“色谱”已经失去原来含义，但仍沿用到今。（动画）2020/1/18色谱法原理当流动相中携带的混合物流经固定相时，其与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序从色谱柱中流出。（动画）与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相及两相的相对运动构成了色谱法的基础2020/1/182.色谱法分类按流动相的状态不同主要分为两类：(1)气相色谱：流动相为气体（称为载气）。按分离柱不同可分为：填充柱色谱和毛细管柱色谱；按固定相的不同又分为：气固色谱和气液色谱2020/1/18(2)液相色谱：流动相为液体（也称为淋洗液）。按固定相的不同分为：液固色谱和液液色谱。离子色谱：液相色谱的一种，以特制的离子交换树脂为固定相，不同pH值的水溶液为流动相。2020/1/18(3)其他色谱方法薄层色谱和纸色谱：比较简单的色谱方法凝胶色谱法：测聚合物分子量分布。超临界色谱:CO2流动相。高效毛细管电泳:九十年代快速发展、特别适合生物试样分析分离的高效分析仪器。2020/1/18按分离机理分类利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能力强弱不同而得以分离的方法，称为吸附色谱法。•利用组分在固定液（固定相）中溶解度不同而达到分离的方法称为分配色谱法。•利用组分在离子交换剂（固定相）上的亲和力大小不同而达到分离的方法，称为离子交换色谱法。•利用大小不同的分子在多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法，称为凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法。•最近，又有一种新分离技术，利用不同组分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离的技术称为亲和色谱法，常用于蛋白质的分离。2020/1/18按固定相的外型分类•固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。•固定相呈平板状的色谱，称为平板色谱，它又可分为薄层色谱和纸色谱。按照展开程序分类按照展开程序的不同，可将色谱法分为洗脱法、顶替法、和迎头法。2020/1/18•洗脱法也称冲洗法。工作时，首先将样品加到色谱柱头上，然后用吸附或溶解能力比试样组分弱得多的气体或液体作冲洗剂。由于各组分在固定相上的吸附或溶解能力不同，被冲洗剂带出的先后次序也不同，从而使组分彼此分离。流出曲线见下图。这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。AB2020/1/183.色谱法的特点（1）分离效率高复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。（2）灵敏度高可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。（3）分析速度快一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。（4）应用范围广气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。不足之处：被分离组分的定性较为困难。2020/1/18二、色谱分离过程色谱分离过程是在色谱柱内完成的。以气相色谱为例。气固(液固)色谱和气液(液液)色谱，两者的分离机理不同。气固(液固)色谱的固定相:多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。气液(液液)色谱的固定相:由担体和固定液所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。气固色谱的分离机理:吸附与脱附的不断重复过程；气液色谱的分离机理：溶解与挥发的反复多次分配过程。2020/1/18气相色谱分离过程当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附;随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附;挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附;随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行；较难被吸附（溶解）的组分随载气较快地向前移动，较易被吸附（溶解）的组分则随载气较慢地移动。经过一定时间后，各组分就彼此分离。2020/1/18色谱峰的定义由检测器输出的电信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。三、色谱流出曲线与术语1.基线无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。2.色谱峰当某组分从色谱柱流出时，检测器对该组分的响应信号随时间变化所形成的峰形曲线称为该组分的色谱峰。3.峰高(h)色谱峰顶到基线的垂直距离（动画）2020/1/184.保留值表示试样中各组分在色谱柱中滞留时间的数值。（1）时间表示的保留值保留时间（tR）：组分从进样到柱后出现浓度极大值（即色谱峰顶值）时所需的时间；（动画）调整保留时间（tR＇）：tR＇=tR－t0死时间（t0）：不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；2020/1/18（2）用体积表示的保留值保留体积（VR）：VR=tR×F0F0为柱出口处的载气流量，单位：mL/min。死体积（V0）：V0=t0×F0调整保留体积(VR＇)：VR＇=VR－V0保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组分的保留时间常受到流动相流速的影响，因此常用保留体积来表示保留值。2020/1/18死体积讨论死体积指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测器的空间的总和。当后两相很小可忽略不计时，死体积可由死时间与色谱柱出口的载气流速Fo（cm3·min-1）计算。•仅适用于气相色谱，不适用于液相色谱。2020/1/185.相对保留值r2，1组分2与组分1调整保留值之比：r2，1=t´R2/t´R1=V´R2/V´R1相对保留值只与柱温和固定相性质有关，与其他色谱操作条件无关，它表示了固定相对这两种组分的选择性。所以又称为选择因子。2020/1/186.区域宽度用来衡量色谱峰宽度的参数，有三种表示方法：（1）标准偏差()：即0.607倍峰高处色谱峰宽度的一半。（2）半峰宽(W1/2)：色谱峰高一半处的宽度W1/2=2.354（3）峰底宽(Wb)：Wb=42020/1/18色谱流出曲线的意义由色谱流出曲线可以实现以下目的：（1）根据色谱峰的数目，可以判断试样中所含组分的最少个数。（2）根据色谱峰的保留值进行定性分析。（3）依据色谱峰的面积或峰高进行定量分析。（4）依据色谱峰的保留值以及峰宽评价色谱柱的分离效能。2020/1/18•色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离，组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的热力学性质有关。•但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。2020/1/18第二节色谱理论基础一、塔板理论platetheory二、速率理论ratetheory三、分离度resolutionfundamentalofchromatographtheory2020/1/18一、塔板理论（一）分配过程1.分配系数（partionfactor）K组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g/mL）比，称为分配系数，用K表示，即：MsccK组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度分配系数是色谱分离的依据。2020/1/18分配系数K的讨论一定温度下，组分的分配系数K越大，出峰越慢；试样一定时，K主要取决于固定相性质；同一个组份在不同的固定相上的分配系数K不同；选择适宜的固定相可改善分离效果；试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础；某组分的K=0时，即不被固定相保留，最先流出。组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度K2020/1/182.分配比（partionradio）k在实际工作中，也常用分配比来表征色谱分配平衡过程。分配比是指，在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的质量比：Msmmk组分在流动相中的质量组分在固定相中的质量1.分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数，随分离柱温度、柱压的改变而变化。2.分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数，数值越大，该组分的保留时间越长。3.分配比可以由实验测得。分配比也称：容量因子(capacityfactor)；容量比(capacityfactor)；2020/1/18（1）容量因子与分配系数的关系式中β为相比，即β=Vm/Vs。填充柱相比：6～35；毛细管柱的相比：50～1500。容量因子越大，保留时间越长。VM为流动相体积，即柱内固定相颗粒间的空隙体积；VS为固定相体积，对不同类型色谱柱，VS的含义不同:气-液色谱柱：VS为固定液体积；气-固色谱柱：VS为吸附剂表面容量；KVVccmmkmSmsmS2020/1/18（2）分配比与保留时间的关系0'R00Rtttttk某组分的k值可由实验测得，等于该组分的调整保留时间与死时间的比值：（3）分配系数K及分配比k与选择因子r2,1的关系1212121,2kkKKttrRR如果两组分的K或k值相等，则r2,1=1，两组分的色谱峰必将重合，说明分不开。两组分的K或k值相差越大，则分离得越好。因此两组分具有不同的分配系数是色谱分离的先决条件。2020/1/18下图是A、B两组分沿色谱柱移动时，不同位置处的浓度轮廓。溶质A和B在沿柱移动时不同位置处的浓度轮廓浓度沿柱移动距离LABKAKB2020/1/18图中KAKB，因此，A组分在移动过程中滞后。随着两组分在色谱柱中移动距离的增加，两峰间的距离逐渐变大，同时，每一组分的浓度轮廓（即区域宽度）也慢慢变宽。显然，区域扩宽对分离是不利的，但又是不可避免的。若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：1.两组分的分配系数必须有差异；2.区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；3.在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。第一、二点是完全分离的必要条件。作为一个色谱理论，它不仅应说明组分在色谱柱中移动的速率，而且应说明组分在移动过程中引起区域扩宽的各种因素。塔板理论和速率理论均以色谱过程中分配系数恒定为前提，故称为线性色谱理论。2020/1/18基本保留方程可表示为：tR=t0(1+k)若载气流量F0恒定，也可用保留体积表示，则VR=Vm+KVs这就是色谱基本保留方程。上式说明，色谱柱确定后，Vm和Vs即为定值。由此可见，分配系数不同的各组分具有不同的保留值，因而在色谱图上有不同位置的色谱峰。（4）基本保留方程2020/1/18例：用一根固定相的体积为0.148mL，流动相的体积为1.26mL的色谱柱分离A,B两个组分，它们的保留时间分别为14.4min，15.4min，不被保留组