实验一 细菌转化

主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验主讲人：王兴平E－mail：[e-mail]细菌转化主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验一、实验目的感受态细胞的制备方法。掌握质粒DNA转化感受态受体菌技术。主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验主讲人：王兴平E－mail：[e-mail]细菌转化主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验二、实验原理转化指用氯化钙处理宿主细胞（大肠杆菌JM109）,以利其将DNA重组子转入细胞内，在宿主细胞内进行增殖。感受态细胞：即通过0.1MCaCl2处理细胞，增加膜对DNA的通透性，以增加细胞吸收外源DNA的效率，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验三、实验器材、试剂1.器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。2.试剂：30%甘油、0.1MCaCl2、氨卞青霉素（Amp）水溶液、X-gal、IPTG水溶液、LB培养液、含Amp的LB固体平板。主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验四、感受态细胞的制备1.复苏EcoliJM110菌株，于LB平板上划线接种，37℃培养9-10h。2.挑单菌落接种于300mLLB液体培养基（三角瓶）中，37℃振荡培养5-6h，（或者取原菌1:100加入到LB中，37℃振荡培养3-4h）使细胞处于对数生长期（用紫外分光光度计测定菌至OD600值达到0.4-0.5）。3.分装6大管，每管50mL，冰上预冷30min，4000转，4℃离心5min。主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验4.弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1MCaCl2（液体中有冰粒时效果最好），合为2管后，每管再补10mL0.1MCaCl2至40mL，冰浴30min，4000转，4℃离心5min。5.弃上清，每管加10mL预冷至0℃的0.1MCaCl2后，重悬菌体沉淀，合为1管，冰浴10-15min，即得感受态细胞。四、感受态细胞的制备主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验6.现制现用，或加入20mL等体积的30%的灭菌甘油。7.分装200管（每管200l），投入液氮快速冷冻后，-70℃保存。8.用标准质粒进行转化，若长出许多蓝斑菌落，证明感受态细胞的效价高。四、感受态细胞的制备主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验1.取一支感受态细胞在冰上解冻后，将100l感受态加入到10l的连接产物中，混匀。2.冰浴30min。3.42℃水浴90sec（其间勿摇晃离心管）。4.立即冰浴2min。5.加入800lLB液体培养基（不加Amp），于37℃，小于200rpm振荡培养1h以复苏细胞。五、转化的操作步骤主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验6.给4lIPTG和40lX-gal充分混匀后用三角玻棒均匀地涂布于含100g/mLAmp的LB选择性平板上，待液体被吸干即可用于涂布转化的细菌。7.将复苏好的细胞3000转离心2min，丢上清800l，轻柔地将细菌悬浮，涂板。8.待液体完全渗入琼脂后，倒扣平板，于37℃温箱中培养10h以上。9.取出置于4℃放置数h，重组子筛选。五、转化的操作步骤主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验六、转化率及其影响因素载体DNA及重组DNA受体细胞转化操作试剂纯度与器皿的洁净度主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验参考资料主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验1.影响转化效率的因素有哪些？2.白色菌落出现的原理是什么？思考题主讲人：王兴平E-mail:[e-mail]基因工程实验Thanksforyourattention