实验一_微生物培养基的配制和灭菌

微生物学实验课堂纪律严格遵守实验室规章制度严肃课堂纪律不允许无故旷课、早退迟到工作服进入微生物实验室的注意事项1.进入实验室必须穿白大褂2.实验室内不准吃东西3.在实验室内不要趴在桌子上4.实验完成后值日生留下做好清洁工作（值日工作实行组长负责制，纳入实验成绩）5.离开实验室前洗手6.实验现象要隔天观察的实验，必须要按时到实验室记录实验现象实验安排实验一微生物培养基的配制和灭菌实验二微生物的纯培养技术实验三显微镜油镜的使用及细胞形态的观察实验四土壤、水的细菌学检查实验五放线菌、霉菌及酵母菌的形态观察实验六环境因素对微生物的影响实验七微生物生理生化反应观察实验八微生物遗传实验实验报告要求一个实验，一份实验报告，有连续性的实验等到做完后再写实验报告。实验报告内容：1.实验项目名称2.实验目的3.实验原理4.实验步骤5.实验结果与分析（即使实验失败也要写好分析）6.思考题实验一微生物培养基的配制和灭菌一、实验目的了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。掌握加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。（一）培养基的配制二.实验原理1.培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。不同微生物对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。培养基按成分可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基；按物理状态可分为固体培养基、半固体培养基（0.2%～0.5%的琼脂）和液体培养基；按用途可分为基础培养基、营养培养基、鉴别培养基和选择培养基等。培养基是指由人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。培养基简介碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水营养物质的浓度要适宜营养物质之间的配比要适宜培养基的pH值、渗透压、水活度和氧化还原电势等物理化学条件要适宜。细菌：pH7.0~8.0放线菌：pH7.5~8.5酵母菌：pH3.8~6.0霉菌：pH4.0~5.8藻类：pH6.0~7.0原生动物：pH6.0~8.0初始pH通常培养条件：培养基的种类按照培养基的物理状态可分为1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。2.固体培养基：在液体培养基中加入2%左右的凝固剂的固体状态的培养基。3.半固体培养基：在液体培养基中加入0.2—0.5%凝固剂而成的半固体状培养基。琼脂是最优良的凝固剂，自1880年开始用于配制微生物培养基以来，至今经久不衰。实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；称量--配置--调节pH值--过滤--分装--灭菌1.称量按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯中。对于不是粉状（如肉膏），应用烧杯称量。培养基配制的基本步骤2.配调向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。如果配方中含有淀粉，先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌，然后加足水分及其他药品，待完全熔化后补足所失水分。3.调节pH值培养基溶解均匀并冷却至室温时用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1molHcl和1molNaOH），要缓慢少量且多加搅拌。培养基配方为自然pH时，不用调节。4.过滤用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。5.分装将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。固体培养基要趁热装。分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。分装量可分为下面几方面：（1）斜面：装量为管长的1/4-1/5。（2）液体培养基、高层培养基、半固体培养基：装载量不超过管长的1/3。（3）三角瓶：装量不超过容积1/2。6.灭菌塞棉塞，包扎，灭菌。高压蒸汽灭菌法：是在密闭的加压容器内进行，加热使器内的水产生蒸汽，由于密闭，增加了器内的压力，使水的沸点升高，从而获得高于100度的蒸汽温度。牛肉膏蛋白胨固体培养基配方：牛肉膏0.3g蛋白胨1g氯化钠0.5g琼脂1.5g水100mLpH7.2~7.4灭菌121℃，20min牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方：琼脂0.3g牛肉膏蛋白胨液体培养基配方：琼脂0g牛肉膏蛋白胨培养基的配制1、固体培养基（平板制作）2、固体培养基（斜面制作）2、半固体培养基3、液体培养基三.操作步骤及本次实验具体安排（一）平板固体培养基制作（由第1,2,3,4组同学各做2X100ml）1.称取一定量的营养琼脂到250ml的三角瓶中.2.加入100mL水.3.塞上硅胶塞,用牛皮纸包扎好;4.高压蒸汽灭菌5.灭菌后,当培养基冷却至50℃左右时,倾注平皿(每100ml可制备5-6个平皿)6.凝固后放冰箱备用（二）斜面培养基制作（由第5,6组同学各做25支斜面培养基）1.称取一定量的营养琼脂到100ml的三角瓶中.2.加入100mL水.3.放入水浴锅内溶解.4.在空试管内倒入2～3mL已经溶解好的培养基，【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞.5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌.6.摆斜面,凝固后放冰箱备用.用于活化菌种，或培养菌种的斜面用于保存菌种的斜面搁置斜面当培养基冷却至50℃左右时，将试管带棉塞的一端搁在一根木棒上。搁置的长度要合适，使培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的一半。（三）半固体培养基制作（由第7,8组同学各做25支半固体培养基）1.按牛肉膏蛋白胨半固体培养基配方称取相应成分到250ml的三角瓶中.2.加入100mL水.3.放入水浴锅内溶解.4.在空试管内倒入2～3mL已经溶解好的培养基，【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞.5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌.6.凝固后放冰箱备用.牛肉膏蛋白胨半固体培养基按下列配方及方法配制牛肉膏:0.3g蛋白胨:1gNaCl:0.5g琼脂:0.3g水:100mlpH:7.0-7.2放入水浴锅内溶解后,分装到试管中,灭菌备用.（四）液体培养基制作（由第9,10组同学各做25支液体培养基）1.按牛肉膏蛋白胨液体培养基配方称取相应成分到250ml的三角瓶中.2.加入100mL水.3.充分溶解.4.在空试管内倒入2～3mL已经溶解好的培养基，【注意尽量不要让培养基沾到试管口】塞好硅胶塞.5.放入烧杯中,高压蒸汽灭菌.6.冷却后放冰箱备用.牛肉膏蛋白胨液体体培养基按下列配方及方法配制牛肉膏:0.3g蛋白胨:1gNaCl:0.5g水:100mlpH:7.0-7.2放入水浴锅内溶解后,分装到试管中,灭菌备用.各组任务：第1-4组配制固体培养基，制平板；第5.6组配制固体培养基，制斜面；第7,8组配制半固体培养基；第9,10组配制液体培养基。注：试管加棉塞(最好)培养基分装完毕以后，在管口上加一个棉塞。棉塞能防止杂菌污染，保证通气良好。加棉塞时，应使棉塞长度的2/3在试管口内，如下图所示。任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。常用的灭菌的方法有：干热灭菌、高压蒸汽灭菌、常压蒸汽灭菌、常压间歇式灭菌超高温灭菌、过滤除菌、辐射灭菌、化学药品灭菌等方法。本实验培养基的灭菌常使用的是高压蒸汽灭菌，它是利用高温湿热空气使菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的。（二）培养基的灭菌高压蒸气灭菌一般培养基:1.05Kg/cm2,121.3℃,15-30min含糖培养基:0.56Kg/cm2,112.6℃,15-30min培养基的灭菌器皿的灭菌：干热空气：160℃，2小时无菌室的消毒：紫外光化学药物熏蒸（苯酚；高锰酸钾+甲醛）灭菌锅湿热灭菌使用的设备操作过程加水装锅盖盖加热当压力升为0.5kg/cm2时排放冷空气正式升压保压（1.1kg/cm2，121℃，保持20-30min）停止加热自然降压至零排放余汽开盖取出灭菌物品趁热摆斜面检验灭菌效果。本次实验报告内容记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。思考题培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理?已灭菌的培养基如何进行无菌检查?实验报告下次实验时上交