第八版生物化学与分子生物学 DNA的生物合成

目录生物化学与分子生物学目录第十四章DNA的生物合成DNABiosynthesis(Replication)目录复制(replication)是以DNA为模板的DNA合成，是基因组的复制过程。在这个过程中，亲代DNA作为合成模板，按照碱基配对原则合成子代分子，其化学本质是酶促脱氧核苷酸聚合反应。复制亲代DNA子代DNA目录本章主要内容：DNA复制的基本特征DNA复制的酶学和拓扑学变化原核生物DNA复制过程真核生物DNA生物合成过程逆转录和其他复制方式DNA复制的基本特征BasicRulesofDNAReplication第一节目录半保留复制(semi-conservativereplication)双向复制(bidirectionalreplication)半不连续复制(semi-discontinuousreplication)DNA复制的主要特征目录一、DNA以半保留方式进行复制DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。半保留复制的概念:目录子链继承母链遗传信息的几种可能方式:全保留式半保留式混合式密度梯度实验:——实验结果支持半保留复制的设想。含15N-DNA的细菌培养于普通培养液第一代继续培养于普通培养液第二代梯度离心结果目录按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义:遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。目录AGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+母链DNA复制过程中形成的复制叉子代DNA目录原核生物基因组是环状DNA，只有一个复制起点（origin）。复制从起点开始，向两个方向进行解链，进行的是单点起始双向复制。二、DNA复制从起点向两个方向延伸复制中的放射自显影图象A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter)oriterABC目录真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子(replicon)。复制子是独立完成复制的功能单位。5’3’oriorioriori5’3’5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’复制3’目录三、DNA复制反应呈半不连续特征3535解链方向领头链(leadingstrand)后随链(laggingstrand)目录顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链(leadingstrand)。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为后随链(laggingstrand)。复制中的不连续片段称为岡崎片段(okazakifragment)。领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。目录DNA复制的酶学和拓扑学变化第二节TheEnzymologyandTopologyofDNAReplication目录参与DNA复制的物质:底物(substrate):dATP,dGTP,dCTP,dTTP；聚合酶(polymerase):依赖DNA的DNA聚合酶，简写为DNA-pol；模板(template):解开成单链的DNA母链；引物(primer):提供3-OH末端使dNTP可以依次聚合；其他的酶和蛋白质因子。目录(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPiRNA引物RNA引物子代DNA目录聚合反应的特点:DNA新链生成需RNA引物和模板；新链的延长只可沿5→3方向进行。目录一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合全称：依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase)简称：DNA-pol活性：1.53的聚合活性2.核酸外切酶活性5´AGCTTCAGGATA3´|||||||||||3´TCGAAGTCCTAGCGAC5´35外切酶活性:53外切酶活性:?能切除突变的DNA片段。能辨认错配的碱基对，并将其水解。核酸外切酶活性:目录（一）原核生物有3种DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ目录原核生物的DNA聚合酶可能不可能可能基因突变后的致死性无无有5→3核酸外切酶活性20？400分子数/细胞多亚基不对称二聚体？单肽链组成250120109分子量(kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI可能不可能可能基因突变后的致死性无无有5→3核酸外切酶活性20？400分子数/细胞多亚基不对称二聚体？单肽链组成250120109分子量(kD)DNA-polIIIDNA-polIIDNA-polI目录•２个核心酶•1个-复合物（、、、、、6种亚基）•1对-亚基（可滑动的DNA夹子）DNA聚合酶Ⅲ全酶结构全酶结构包括：目录亚基（130000）主要功能是合成DNA亚基具有35外切酶活性（复制保真性所必需）亚基可增强其活性亚基可能起组装作用核心酶由、和亚基组成：两侧的β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用目录2个-亚基分别和1个核心酶相互作用，其柔性连接区可以确保在复制叉1个全酶分子的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合成前导链和后随链。功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用-复合物由6种亚基组成：、、、、、目录功能：DNA-polⅠ（109kD）对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。目录323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段604个氨基酸DNA聚合酶活性5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ•Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。目录DNA-polⅡ（120kD）•DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。•DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。目录（二）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种DNA-pol起始引发，有引物酶活性。延长子链的主要酶，有解螺旋酶活性。参与低保真度的复制。在复制过程中起校读、修复和填补缺口的作用。在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-polDNA-polDNA-polDNA-pol目录真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较E.Coli真核细胞功能Ⅰ填补复制中的DNA空隙，DNA修复和重组Ⅱ复制中的校对，DNA修复DNA修复线粒体DNA合成Ⅲ前导链合成DnaG引物酶后随链合成目录真核生物的DNA聚合酶填补引物空隙，切除修复，重组延长子链的主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制低保真度的复制起始引发，引物酶活性功能+++--3→5核酸外切酶活性高高高？中5→3聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol填补引物空隙，切除修复，重组延长子链的主要酶，解螺旋酶活性线粒体DNA复制低保真度的复制起始引发，引物酶活性功能+++--3→5核酸外切酶活性高高高？中5→3聚合活性25.512.514.04.016.5分子量（kD）εδγβαDNA-pol目录二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能实现复制的保真性复制按照碱基配对规律进行，是遗传信息能准确传代的基本原理。此外还需酶学的机制来保证复制的保真性。目录遵守严格的碱基配对规律；聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能；复制出错时有即时校对功能。DNA复制的保真性至少要依赖三种机制：目录（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择利用“错配”实验发现，DNApolⅢ对核苷酸的参入（incorporation）具有选择功能。DNApolⅢ对嘌呤的不同构型表现不同亲和力，因此实现其选择功能。目录（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的酶，外切酶是有方向性的。目录A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。DNApolⅠ的校读功能目录三、复制中的解链伴有DNA分子拓扑学变化DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有把DNA解成单链，它才能起模板作用。目录（一）多种酶参与DNA解链和稳定单链状态理顺DNA链拓扑异构酶(gyrA,B)稳定已解开的单链单链DNA结合蛋白SSB催化RNA引物生成引物酶DnaG(dnaG)运送和协同DnaBDnaC(dnaC)解开DNA双链解螺旋酶DnaB(dnaB)辨认起始点DnaA(dnaA)蛋白质（基因）通用名功能原核生物复制起始的相关蛋白质目录E.Coli基因图目录解螺旋酶(helicase)——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。引物酶(primase)——复制起始时催化生成RNA引物的酶。单链DNA结合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)——在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整。目录108局部解链后（二）DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态复制过程正超螺旋的形成：目录解链过程中正超螺旋的形成目录既能水解、又能连接磷酸二酯键。拓扑异构酶Ⅰ拓扑异构酶Ⅱ拓扑异构酶分类：拓扑异构酶作用特点：目录拓扑异构酶Ⅰ切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。反应不需ATP。拓扑异构酶Ⅱ切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。作用机制：目录拓扑酶的作用方式：目录四、DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。DNA连接酶(DNAligase)作用方式：POO-O-OHO5’POO-O-O3’3’5’DNA连接酶ATPADP5’3’5’3’DNA连接酶的作用：目录DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。也是基因工程的重要工具酶之一。功能：目录提供核糖3-OH提供5-P结果DNA聚合酶引物或延长中的新链游离dNTP去PPi(dNTP)n+1连接酶复制中不连续的两条单链不连续→连续链拓扑酶切断、整理后的两链改变拓扑状态DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3,5-磷酸二酯键生成的比较目录原核生物DNA复制过程TheProcessofDNAReplicationinProkaryotes第三节目录起始是复制中较为复杂的环节，在此过程中，各种酶和蛋白因子在复制起始点处装配引发体，形成复制叉并合成RNA引物。需要解决两个问题：1.DNA解开成单链，提供模板。2.形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。一、复制的起始目录E.coli复制起始点oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···11317293244···TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA5866166174201209237245串联重复序列反向重复序列5353（一）DNA的解链目录原核生物的复制起始部位及