重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

转化及转化子的鉴定11243224周雨一、感受态细胞的制备1、材料：E.coliDH5α菌株:Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA:购买或实验室自制,eppendorf管。2、设备：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱,恒温水浴锅,制冰机,分光光度计,微量移液枪。3、试剂：LB固体和液体培养基，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，麦康凯培养基(MaconkeyAgar)，0.05mol/LCaCl2溶液，含15%甘油的0.05mol/LCaCl2。4、受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落,接种于3-5mlLB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100mlLB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600＝0.5左右。5、感受态细胞的制备(CaCl2法)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。二、转化1、DNA和感受态细胞都置于37度恒温水浴锅中激活，然后将DNA转移到感受态细胞悬液中，反复吹打，使其均匀接触（由于细菌可以从环境中直接吸收DNA）；2、运用热胀冷缩的原理，将混悬液放在冰水浴中半个小时到40分钟（最短时间），使得DNA与细胞表面受体结合；3、轻轻的将混悬液置于37到45度的水浴锅45秒；4、平稳快速的转入冰水浴中2分钟；5、取出，加入900ul的37℃预热的LB培养基，混匀；6、放入37度的培养箱1小时，让菌苏醒，恢复生长；7、取适当离心（3000至4000r/min，1min，弃部分上清液200微升）的管中细胞均匀地接种在选择培养基（LB培养基+某种抗生素）；8、提前一天进行抗生素平板，培养基灭菌，之后，加入抗生素（青霉素），分布均匀，冷却至60度以下，适当摇瓶，摇着冷却，混匀后，涂平板，冷却凝固，再放入冰箱充分凝固，再在37度培养箱1小时，烘干水，离心，3000-4000r/min1min，去上清；9、挑选部分的菌落，至少5个（随机）单菌落，进行扩大培养，以便于鉴定；10、将菌作为PCR模板进行扩增（菌落PCR)；11、进行菌种保藏，在液体培养基上；12、再将菌种送到公司测序，如果是碱基突变、引起氨基酸变化等，就需要重新开始做。二、转化子的筛选鉴定(一)菌落PCR鉴定重组DNA转化宿主细胞后，并非所有的受体细胞都能被导入重组DNA分子，一般仅有少数重组DNA分子能进入受体细胞，同时也只有极少数的受体细胞在吸纳重组DNA分子之后能良好增殖。并且它们是与其他大量未被转化的受体菌细胞混杂在一起。再者，在这些被转化的受体细胞中，除部分含有我们所期待的重组DNA分子外，另外一些还可能是由于载体自身或一个载体与多个外源DNA片段形成非期待重组DNA分子导入所致。因此必须使用各种筛选及鉴定手段区分转化子与非转化子，并从转化的细胞群体中分理出带有目的基因的重组子。本实验中采用的方法是平板筛选法电泳筛选法及PCR检测方法。抗药性筛选主要用于重组质粒DNA分子的转化子的筛选，而不含重组质粒DNA分子的受体菌则不能存活，α互补筛选法是根据菌落颜色筛选含有充足质粒的转化子。质粒PET28a携带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）,在含有氨苄青霉素平板上筛选转化子。没有导入质粒PET28a的受体细胞，在含有氨苄青霉素的平板上不生长。质粒PET28a进入E.coliO157：H7后，通过α-互补作用，形成完整的β-半乳糖苷酶。在麦康凯培养基平板上，转化子利用β-半乳糖苷酶分解培养基中的乳糖产生有机酸，pH降低，培养集中的指示剂变红，转化子的菌落变红。不含质粒的E.coliO157：H7，没有β-半乳糖苷酶活性，不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，而是利用培养集中的有机碳源，不使培养基pH降低，在不含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。重组后的载体DNA因为目的基因的插入位点在PET28a乳糖利用基因内部，不能形成α-互补作用，所以也不能利用培养集中的乳糖产生有机酸，在含有氨苄青霉素的麦康凯培养基上形成白色菌落。挑选在氨苄青霉素培养基上生长的白色菌落，通过扩增培养。因为许多菌落存在假阳性情况，在氨苄青霉素培养基上的白色菌落可能是导入的重组载体DNA菌落，也可能是载体自连后发生突变的菌落，所以还要鉴定转化子中重组质粒DNA分子的大小，可将重组的载体DNA提取出来，进行后续的酶切、电泳检验。也以提取的重组质粒为模板，利用现有的引物，进行PCR扩增，检测质粒是否是所期望的重组质粒。流程感受态细胞的制备→质粒转化与重组子的筛选→重组子的挑取与复证→重组质粒的提取与检测结果分析1、酶切电泳图的结果及分析12345678910111213141516171817,18泳道分别是标准λDNA酶切和自己的λDNA酶切后的产物的条带。15泳道为marker，16泳道是未酶切的λDNA的条带。12，13,14泳道分别是PET28a和商品PET28a酶切。1泳道为我们的样品，是经酶切过的DNAPET28a质粒，从图中可以看出只有有一条主带，这条是被HindIII切开的线性DNAPET28a质粒，与DNAmarker比较查资料可知分子量为2322，且可根据亮度看出含量不是很高。但是可以判断出我们组的载体质粒PET28a酶切很彻底。其他组的条带有些下面还有一条很浅的带是超螺旋DNAPET28a质粒，即没有被切开的质粒，分子量为2027。2重组子筛选结果转化后，10个平板的菌落状况：顺序平板现象解释Ⅲ（感受态细胞）50ul麦氏Ap-培养基呈橙红色，菌落布满平板呈白色，无单菌落DN5α是氨苄敏感型，不能在AP+的平板上生长Ⅲ（感受态细胞）50ul麦氏AP+培养基呈红色，无菌落生长Ⅱ（感受态细胞+PET28a）50ul麦氏AP+生长了较多的单菌落，菌落呈现紫红色PET28a是氨苄抗性，导入受体细胞，与受体DH5α发生α互补作用分解乳酸，培养基PH下降，指示剂变红，转化子菌落变红Ⅰ（感受态细胞+连麦氏AP+既有白色单菌落又有红部分转化子导入的是发生自连的接DNA）50ul色单菌落。接种的体积越多，但菌落数量越多。完整的PET28a质粒可发生α互补作用使菌落变红，部分转化子导入了重组质粒（即重组子），载体多克隆位点插入外源片段后不能利用乳糖而是利用其他营养物质使菌落呈现白色。Ⅰ100ul麦氏AP+Ⅰ150ul麦氏AP+Ⅰ200ul麦氏AP+（二）质粒双酶切鉴定（1）进行酶切反应酶切反应液的配制:ddH2O22μlHindⅢ1μlBamHI1μl10×buffer3μl需要酶切的DNA3μl酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。（2）电泳检测反应结束后，向反应液中加入2.2μl10×loadingbuffer，混匀以停止酶切反应，所有22.2μl样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：120V,45分钟左右。电泳后，观察酶切结果是否与预期的相符，即观察产品的大小；（3）切胶回收；（4）扩大培养（同上的扩大培养）；（5）进行测序，看自己是否获取了正确的转化子。