第1章 植组织培养实验室的构建和操作技术

第1章植物组织培养实验室构建及操作技术大家好！植物组织培养学本章教学目的与要求：(1)掌握组织培养实验室的设计；(2)掌握组织培养常用的实验仪器设备及其使用方法；(3)掌握调控组织培养的主要环境条件。(4)掌握灭菌和消毒的区别；(5)掌握灭菌的不同方法和具体操作过程；(6)掌握无菌接种的步骤；(7)掌握外植体的培养方法和步骤；(8)一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法；(9)掌握试管苗驯化的基本程序；第1章植物组织培养实验室构建及操作技术第1章植物组织培养实验室构建及操作技术植物组织培养学商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备培养基及其配制外植体的选择与培养试管苗的驯化与移栽第1章植物组织培养实验室构建及操作技术本章主要内容1、培养器皿的清洗；2、培养基的配制、分装和高压灭菌；3、无菌操作——材料的表面灭菌和接种；4、将培养物放到培养室培养；5、试管苗的驯化、移栽和初期管理。第1章植物组织培养实验室构建及操作技术第一节商业性组织培养实验室和小工厂的设计与主要设备一般组织培养的操作工序：准备室温室驯化室培养室无菌操作室缓冲室实验室组成一、设计：第一节组织培养实验室的设计与主要设备二、仪器设备和器皿用具1、超净工作台或接种箱2、空调3、除湿机或加湿器4、恒温培养箱5、高压灭菌锅6、冰箱7、天平8、显微镜9、水浴锅10、摇床与转床11、蒸馏水发生器12、酸度计13、离心机（一）常见仪器设备第一节组织培养实验室的设计与主要设备1、培养器皿：试管、三角瓶、培养皿、圆形培养瓶、果酱瓶2、分注器3、离心管4、刻度移液管5、细菌过滤器6、实验器皿：量筒、烧杯、容量瓶、试剂瓶、塑料瓶、酒精灯等。第一节组织培养实验室的设计与主要设备（二）各类玻璃器皿1、镊子：尖头镊子、枪形镊子2、剪子3、解剖刀4、接种针5、钻孔器第一节组织培养实验室的设计与主要设备（三）器械用具第二节培养基及其配制本节目的要求：(1)一般掌握培养基的种类、特点；(2)掌握基本培养基的配方；(3)一般掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；(4)掌握培养基母液和常用培养基的配制方法；(5)熟练掌握培养基的灭菌方法；(6)一般掌握培养基的筛选办法。第1章植物组织培养实验室构建及操作技术一、培养基的成分第二节培养基及其配制其它添加物碳水化合物植物生长调节剂有机营养物无机营养物培养基组成1、无机营养元素(inorganicelement)1)大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元素。[N、P、K、Mg、S和Ca等]。2)微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。[Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等]。第二节培养基及其配制2、有机化合物(organiccompound)最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。使用浓度在1%—5%，常用3%作用：碳源；维持培养基渗透压。（1）碳水化合物第二节培养基及其配制在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动。种类：VBl(盐酸硫胺素)、VB6(盐酸吡哆醇)、Vpp(烟酸)、Vc（抗坏血酸）、VH(生物素)、VB11(叶酸)、VB12（钴胺素)等。使用浓度：一般用量为0.1—1.0mg／L。（2）维生素(vitamin)第二节培养基及其配制又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用。使用浓度：一般为lOOmg／L，作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。（3）肌醇第二节培养基及其配制作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等。使用浓度：为10—200mg／L。（4）氨基酸(alminoacide）第二节培养基及其配制3、有机附加物（天然复合物）10%—20%150-200ml／L150—200g／L0.01%-0.05%浓度：第二节培养基及其配制有机附加物椰乳香蕉马铃薯酵母提取液4、植物生长调节物质(hormone)赤霉素（gibberellicacid）细胞分裂素类(cytokinin)生长素类(auxin)第二节培养基及其配制*作用：主要被用于诱导愈伤组织形成；促进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。在促进生长方面，根对生长素最敏感。在极低的浓度下，(10-5—10-8mg／L)就可促进生长，其次是茎和芽。（1）生长素类第二节培养基及其配制吲哚乙酸：IAA（indoaceticacid）萘乙酸：NAA（naphthaleneaceticacid）吲哚丁酸：IBA（indolebutyriacid）2,4-二氯苯氧乙酸：2,4—D(2,4-dichlorophenoxybutyricacid)*生长素种类：第二节培养基及其配制IAA(吲哚乙酸)NAA(萘乙酸)IBA(吲哚丁酸)2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸)生长素作用强弱顺序：强弱第二节培养基及其配制种类：6—BA(6—苄基腺嘌呤)Kt(kinetin激动素)Zt(zeatin玉米素)（2）细胞分裂素类细胞分裂素作用：①促进细胞分裂与扩大。②诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长。③抑制根的分化。第二节培养基及其配制Kt(激动素)6—BA(6—苄基腺嘌呤)Zt(玉米素)细胞分裂素作用强弱顺序强弱第二节培养基及其配制GA3（赤霉酸）：作用：促进幼芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株。赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当生长素／赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化。（3）赤霉素第二节培养基及其配制5、培养材料的支持物---琼脂(agar)固体培养时最好的固化剂。用量：6—10g／L。琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。第二节培养基及其配制固体培养基的特点（与液体培养基相比）:优点:操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。缺点:培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。固体培养液体培养第二节培养基及其配制6、抗生物质(antibiotic)种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等。浓度：5—20mg/L。作用：可防止菌类污染。第二节培养基及其配制7、活性炭(activecarbon)目的：是利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响；利于生根。使用浓度：1—5g／L。它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。第二节培养基及其配制8、水（water)作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性。大规模生产时可用自来水。第二节培养基及其配制二、培养基的PH值(pHvalue)1、多数植物要求pH5.6-5.82、用0.1-1N的NaOH和0.1-1N的HCI调节.3、注意：经高压灭菌后，培养基pH会下降0.2-0.8,固调整pH值时,应高于0.5；pH的大小会影响琼脂的凝固能力，当pH6.0时，培养基将会变硬，pH5.0时，琼脂凝固不好。第二节培养基及其配制种类最适pH值种类最适pH值杜鹃4.0月季5.8越桔4.5胡萝卜、石刁柏6.0蚕豆5.5桃7.0番茄5.7第二节培养基及其配制不同植物对培养基最适pH值的要求不同(见表)培养基(culturemedium)：是植物组织培养的重要基质。在离体培养条件下，不同种植物的组织对营养有不同的要求，甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同。因此，没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官，在建立一项新的培养系统时，首先必须找到一合适的培养基，培养才有可能成功。三、培养基的种类、配方及特点第二节培养基及其配制1、根据态相不同：固体培养基、液体培养基2、根据培养物培养过程：初代培养基、继代培养基3、根据作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基4、根据营养水平：基本培养基、完全培养基、改良培养基。（一）培养基的种类第二节培养基及其配制若只含有大量元素与微量元素和碳水化合物的培养基，称为基本培养基。在基本培养基的基础上，添加各种各样的生长调节物质和其他有机附加物的培养基叫完全培养基。初代培养基：指用来第一次接种外植体的培养基。继代培养基：指用来接种继初代培养之后的培养物的培养基。第二节培养基及其配制母液名称药品名称原配方量(mg)/L大量元素母液NH4NO31650KNO31900CaCl·2H2O440MgSO4·7H2O370KH2PO4170微量元素母液MnSO4·H2O22.3ZnSO4·7H2O8.6CoCl·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.02H3BO36.2Na2MO4·2H2O0.25KI0.83铁盐母液FeSO4·7H2O28.7Na2-EDTA37.3有机物母液烟酸(Vpp)0.5盐酸吡哆醇0.5盐酸硫胺素0.1肌醇100甘氨酸2（二）MS培养基配方第二节培养基及其配制1、MS培养基：它是1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。是目前应用最广泛的培养基。特点：是无机盐离子浓度较高，有高含量的N、K，硝酸盐量大，营养丰富。（三）常用的培养基及特点第二节培养基及其配制2、White培养基：1943年由White为培养番茄根尖而设计的。特点：无机盐浓度较低，适于生根培养。3、N6培养基：1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。特点：是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高，不含钼。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花粉和花药培养。第二节培养基及其配制(4)B5培养基:是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。特点：是含有较低的铵盐，较高的硝酸盐和盐酸硫胺素。(5)KM—8P培养基:它是1974年为原生质体培养而设计的。特点：是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素。第二节培养基及其配制四、培养基的配制（一）、母液(stocksolution)的配制和保存所谓母液是欲配制液的浓缩液。意义:①保证各物质成分的准确性②配制时的快速移取③便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。第二节培养基及其配制单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的母液。一般用mg/ml或mg/L表示。混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后再混合成母液。配制生长素类：可先用少量0.1N的NaOH或95%酒精助溶。浓度为：1-5mg／ml。配制细胞分裂素类：一般先用少量0.5-1N盐酸加热溶解。浓度为：1-5mg／ml。第二节培养基及其配制母液的配制方法：ＭＳ培养基母液的配制母液名称药品名称原配方量(mg)/L扩大倍数称取量(mg)母液体积(ml)移取量(ml)/L大量元素母液NH4NO3165010165001000100KNO319001019000CaCl·2H2O440104400MgSO4·7H2O370103700KH2PO4170101700微量元素母液MnSO4·H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860CoCl·6H2O0.0251002.5CuSO4·5H2O0.0210025H3BO36.2100620Na2MO4·2H2O0.2510025KI0.8310083铁盐母液FeSO4·7H2O28.71002870100010Na2-EDTA37.31003730有机物母液烟酸