实验四 过碘酸-雪夫反应

•细胞化学染色是细胞学和化学相结合的一门科学。它是以细胞形态学为基础，根据化学反应的原理、应用涂片染色的方法观察细胞的化学成分及其变化的重要方法。•细胞化学染色研究的对象：细胞和组织中的化学物质•细胞化学染色的要求：•1.保持细胞的生前结构。•2.保存细胞生前的化学成分和酶的活性。•3.所用方法是已知的化学反应或物理变化。•4.反应产物必须是一种有色物质，可以进行显微镜观察。•5.反应产物不能移位，必须有一定的稳定性。•细胞化学染色的步骤：•1.固定：将细胞的生前结构和化学物质保存下来。•2.显示：通过一系列化学反应形成稳定的有色沉淀。•3.复染：使各种细胞都显示出来以便于观察。•细胞化学染色的实用价值•一、协助白血病的诊断•1.急性白血病细胞类型的鉴别。•检查顺序：POXPASNAE+NaFNCE•2.协助慢性白血病的诊断。NAPPAS•二、协助贫血的诊断•1.缺铁性贫血：铁染色•2.再障：NAP•3.铁粒幼细胞性贫血：铁染色•三、鉴别某些容易混淆的细胞以协助诊断•四、协助鉴别良性与恶性的淋巴细胞疾病•五、协助两种感染的鉴别实验四过碘酸-雪夫反应(糖原染色)[目的要求]1．掌握本实验的原理和临床意义。2．熟悉本实验的操作方法及注意事项。[实验原理]糖原中的1，2-乙二醇基经高碘酸氧化后产生醛基，此醛基进而与雪夫(Schiff)液作用，使无色品红变为红色的化合物，定位于胞浆中。[实验器材和试剂]1．10g／L高碘酸液2．雪夫(Schiff)染液3．亚硫酸液4．20g／L甲绿5．染色架、洗耳球、接水盘及吸水纸。6．光学显微镜、香柏油、乙醚和擦镜纸。[实验步骤]•1．新鲜血片或骨髓片用95％乙醇固定10min，蒸馏水冲洗，待干。•2．10g／L高碘酸氧化15～20min，蒸馏水冲洗，待干。•3．置雪夫试液室温染色30～60min。•4．用亚硫酸溶液冲洗3次后，以自来水冲洗2～3min，待干。•5．20g／L甲绿复染10～20min。•6．水洗，待干，镜检。•7．结果•(1)阳性反应：在细胞浆内染红色，呈弥漫状、颗粒或块状。胞核染成绿色。阴性反应，胞浆无色。•(2)反应强度判断标准：•①中性粒细胞的分级标准：•(－)胞浆无红色颗粒。•(+)胞浆内呈淡红色有极少颗粒。•(++)胞浆呈红色，厚而不透明，或有较少颗粒。•(+++)胞浆呈深红色，颗粒紧密，但尚有空隙。•(++++)胞浆呈深紫红色，颗粒紧密，无空隙。②淋巴细胞分级标准：(－)胞浆内无颗粒。(+)胞浆内呈弥散淡红或有少数细颗粒(9个)。(++)胞浆内呈弥散较深的红色或有多数细颗粒(10个)。(+++)胞浆内有较粗颗粒或少数小块状。(++++)胞浆内呈多数粗颗粒并有大块红色物质。③幼红细胞的分级标准：(－)胞浆内无颗粒。(+)胞浆内有少数分散细小颗粒或浅红色弥漫物质。(++)胞浆内有1～10个中等颗粒或弥漫的红色。(+++)胞浆内有11～20个较粗颗粒或呈深红色。(++++)胞浆颗粒较多，20个以上，并且粗，致密且呈紫红色。④巨核细胞的分级标准：(－)细胞内没有糖原，但细胞浆内有弥散性着色，此系其它多糖类物质。(+)含少量糖原，即含数小块或一大块糖原，糖原常定位于近核膜处。(++)胞浆内含有中等糖原，即含许多小块或少数大块糖原，约占胞质的1/3。(+++)胞浆内含有大量糖原，呈大块状，其总面积约占胞浆面积的1/2以上。（＋＋＋＋）胞浆内充满糖原。(3)阳性率和阳性积分：根据不同情况的需要，观察同一类细胞100个，求出阳性率的百分比，将百分率与分级数的积相加，其总和即为积分。实验五过氧化物酶(POX)染色[目的要求]•1．掌握本实验的原理和临床意义。•2．熟悉本实验的操作方法及注意事项。[实验原理]细胞内的过氧化物酶能将底物的过氧化氢分解，产生新生态氧。后者将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，它是一种不稳定的中间产物，再与亚硝基铁氰化钠结合进而生成蓝黑色化合物沉淀于酶的所在部位。[实验器材和试剂]1.0.3％联苯胺乙醇溶液联苯胺0.3g88％乙醇加至100ml2.360g／L亚硝基铁氰化钠饱和液•3.稀过氧化氢液（新鲜配制）•3％过氧化氢0.3ml•蒸馏水25ml••4.瑞氏染液、PH6.4～6.8磷酸盐缓冲液。5.光学显微镜、香柏油、乙醚和擦镜纸。•6.染色架、洗耳球、接水盘及吸水纸。•[实验步骤]•1.取0.3％联苯胺乙醇溶液1ml，360g／L亚硝基铁氰化钠饱和液10µl，混匀。•2.于新鲜干燥血涂片或骨髓片上滴加上述混合液0.5ml，使盖满整个血膜，作用1～2min。•3.滴加等量的稀过氧化氢液，混匀，染4～8min。•4.勿倾去染液，直接用水冲洗。•5.干燥后再用瑞氏染液复染。6.结果在细胞的胞浆中出现蓝色或蓝黑色颗粒为阳性反应。•阳性反应强度的判断：•阴性：无颗粒。•弱阳性：颗粒小，分布稀疏。•阳性：颗粒略粗，分布较密集。•强阳性：颗粒粗大。实验六碱性磷酸酶（NAP）染色[目的要求]1．掌握本实验的原理和临床意义。2．熟悉本实验的操作方法及注意事项。[实验原理]中性粒细胞胞质内的碱性磷酸酶在PH9.6的碱性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞浆中的酶活性处。[实验步骤]1．取新鲜血片自然干燥后放入95％乙醇液固定10min，用流水冲洗，待干。2．取基质液，预温至37℃，将血片置入，继续温育4～6h。3．滴加20g／L硝酸钴，作用5min，蒸馏水冲洗。4．滴加20g／L硫化铵，作用5min，蒸馏水冲洗。5．用20g／L甲绿水溶液复染2～3min或用10g／L伊红复染3～5min。6．水洗，待干，镜检。7．结果(1)正常人的血细胞碱性磷酸酶除中性成熟粒细胞(杆状核及分叶核)可见阳性外，其它细胞均呈阴性。(2)判断标准及分级：(-)0分：胞浆呈淡红色，无任何棕黑色颗粒。(+)1分：胞浆呈均匀浅色，无颗粒或有少量棕黑色颗粒，但不超过胞浆总面积的1／4。(++)2分：全部胞浆呈均匀棕黑色或出现较粗的黑色颗粒，不超过胞浆1／2。(+++)3分：胞浆中已基本充满棕黑色颗粒，但密度较低。(++++)4分：全部胞浆充满粗大棕黑色颗粒而呈深黑色甚至掩盖其胞核。(3)计算积分值：油镜下计数100个中性杆状核、分叶核粒细胞，分别记录其分级情况，全部阳性反应细胞之和即阳性率。将得出各种积分的百分率乘以该积分数，然后相加即为总积分。实验七铁染色[目的要求]1．掌握本实验的原理和临床意义。2．熟悉本实验的操作方法及注意事项。[实验原理]骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质结合不牢，经稀盐酸处理后而游离，并能在酸性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞内铁也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨髓中铁的含量。[实验器材和试剂]1.甲醇2．200g/L亚铁氰化钾溶液3．浓盐酸4.2g/L核固红-硫酸铝溶液[实验步骤]1．选髓粒丰富的骨髓片，用甲醇固定10min。2.配制酸性亚铁氰化钾溶液：200g/L亚铁氰化钾溶液5份浓盐酸1份3．玻片上滴满酸性亚铁氰化钾溶液，染色30min。4．用蒸馏水冲洗后用2g/L核固红-硫酸铝溶液复染10～15min。5．流水冲洗、待干、镜检。6．结果(1)在红色背景下铁粒呈蓝绿色。(2)细胞外铁：用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。(-)：无颗粒所见。(+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠。(++)：有较多的铁颗粒和小珠。(+++)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。(++++)：有极多铁颗粒、小珠，有很多的小块，密集成堆。(3)细胞内铁：用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞浆中含有蓝色铁粒的细胞(铁粒幼红细胞)的百分率。并根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布情况，将铁粒幼红细胞分为四型：I型：幼红细胞内含铁粒1～2粒；Ⅱ型：幼红细胞内含铁粒3～5粒；Ⅲ型：幼红细胞内含铁粒6～10粒；Ⅳ型：幼红细胞内含铁粒10粒。(4)环形铁粒幼红细胞的标准为含铁粒在6粒以上，其中2／3以上的铁粒围核成完全或不完全性环形(围核1／2以上的区域有铁粒环绕)。