第三章+细胞融合与单克隆抗体

第六章细胞融合与单克隆抗体CellFusionandMonoclonalAntibodies6.1细胞融合6.2杂种细胞的遗传特性和应用6.3淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术6.1细胞融合6.1.1细胞融合概念6.1.2人工诱导融合及其机制6.1.3杂种细胞的筛选6.1.1细胞融合细胞融合：指用自然或人工方法、使两个或更多个不同的细胞融合成一个细胞的过程。6.1.1细胞融合融合细胞有两类：一类多核细胞中含有来自同一种亲本的核，这样的融合细胞称为同核体(homokaryon)；而另一类融合细胞中含有分别来自两个亲本的核，被称为异核体(heterokaryon)。图6-1两种亲本细胞融合后得到两种同核体(AA和BB)、一种异核体(AB)和两种未融合的亲本细胞(A和B)6.1.1细胞融合细胞杂交(cellhybridization)特指用人工方法把不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞的技术。细胞杂交所得到的融合细胞叫杂交细胞(hybridcell)或细胞杂交体(cellhybrid)。种内杂交细胞种间杂交细胞6.1.2人工诱导细胞融合病毒诱导细胞融合疱疹病毒、牛痘病毒和副粘液病毒化学方法诱导细胞融合物理方法诱导细胞融合6.1.2.1聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合原理：PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。影响因素：分子量：400—6000（通常：1000—4000）浓度：20—60%（通常：30—50%）时间：3—5minpH：偏碱为宜（pH7.4—8.0）6.1.2.2细胞电融合原理：使细胞在正弦电场下极化成偶极子，并向两极靠近；在向两极靠近的过程中，有些细胞彼此吸引连接在一起，成串排列在两极之间；然后，施加以高强度、短时程的电波刺激，把相互连接的两个或更多细胞的质膜击穿而导致细胞融合。甜菜原生质体电融合过程A在高频电流电场下的相互接触。B脉冲刺激后30sC50秒后E1.5分钟后F6分钟后G15分钟后，原生质体融合完成。电融合优点：融合率高，达70％－80％，甚至100％融合率＝（融合组多核细胞的核数－对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）×100％可在显微镜下定向诱导细胞融合可直接挑选杂种细胞可以直接转入培养6.1.2.3细胞融合机制细胞凝集→质膜融合→胞质融合→细胞核融合6.1.3杂种细胞的筛选原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。植物细胞筛选方式1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。如亲本1：叶绿体缺陷型亲本2：光致死型两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。如：亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能超过50个世代亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体亲本2：叶肉细胞原生质体在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分4）利用生长特性筛选法：利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。动物细胞的筛选方式：1）利用抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。6.2杂种细胞的遗传特性和应用6.2.1杂种细胞在细胞生物学研究中的应用6.2.2杂种细胞在植物育种中的应用6.2.1杂种细胞在细胞生物学研究中的应用1）基因定位不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色体被选择性留下，即染色体分离的现象。由此，可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定染色体上。例如：HGPRT－人细胞与TK－的小鼠细胞融合后，可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E组染色体的杂种细胞，具有TK活性，由此得到人的TK基因是在E组染色体上的。2）遗传缺陷的基因互补基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。通过这种基因互补，可以用正常基因来治疗由于基因突变或基因缺失的疾病。6.2.2杂种细胞在植物育种中的应用杂种细胞是一条新的育种途径，可以产生新经济性状的良种。一些近亲植物、有性不亲和的组合，如马铃薯×番茄等都得到了再生植株。6.3单克隆抗体6.3.1抗体的结构与功能6.3.2单克隆抗体的制备和生产6.3.3单克隆抗体的改造和应用6.3.1抗体的结构与功能抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。抗体分子：由四条肽链所组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）。结合区：抗体分子上有两个抗原结合区可变区（V区）稳定区（C区）人体内的五种抗体6.3.2单克隆抗体的制备单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。单抗的制备过程动物免疫与亲本细胞的选择细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的纯化亲本细胞的选择骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：体内法或体外法。体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。细胞融合将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7—10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。HAT培养基筛选杂交瘤细胞细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超过2×105ml，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。用HAT选择性培养时每隔2－3天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。细胞融合的选择示意图HAT选择系统HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种。杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT-或TK-亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。特异性杂交瘤细胞的筛选通过选择性培养后生长的杂交瘤细胞，仅有部分是分泌预定特异性抗体的杂交瘤细胞。可取上清液，根据抗原的性质、抗体类型及所需灵敏度等具体情况来加以选择。可溶性抗原可采用放射免疫、免疫酶标测定、间接血凝等方法测定。细胞抗原可采用免疫荧光、51Cr释放试验、溶血空斑测定、补体依赖的细胞毒等方法直接测定针对这些抗原的抗体。利用培养基对单抗进行鉴定的过程杂交瘤细胞的克隆化培养利用单个细胞培养技术选育出遗传稳定的分泌特异抗体的细胞系。在培养过程中，一般要加能释放某些生长因子促进杂交瘤生长的饲养细胞，如小鼠的腹腔巨噬细胞、脾细胞或胸腺细胞等。方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、应用荧光激活分选仪等。有限稀释法通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的1）取出阳性孔内的细胞进行计数2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞。4）加入一定数量的饲养细胞，经过8~12天后，可观察到有集落生长的孔。5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。软琼脂培养法在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5％的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25％的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。单抗的大规模生产1）诱生腹水将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。方法是将降植烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种3~5×106杂交瘤细胞。10~20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含1~10mg单抗。2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。6.3.3单克隆抗体的改造和应用单抗作为体内体外诊断试剂在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等单克隆抗体靶向制剂，治疗癌症等疾病单抗作为体内体外诊断试剂现在已经有各种不同类型的单抗试剂合在市场出售，例如乙型肝炎的表面抗原，铁蛋白、促绒毛膜性激素、促甲状腺激素、癌症、艾滋病等诊断试剂。用同位素标记的单抗在特定的组织中成象的技术可以用于肿瘤、心血管畸形的体内诊断。1、单克隆抗体靶向制剂1）药物与单抗直接偶联通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基之间直接形成稳定的酰胺键。利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱，最后还原。这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一定的选择性。如：1，4－溴柔红霉素与肿瘤细胞单抗形成的偶合物，对肿瘤有明显的选择性毒性。2）药物通过小分子与单抗连接通过一些小分子交联剂，把药物分子上的某些基团连接起来。顺乌头酸酐制成的最常用，在中性条件下较稳定，在酸性条件下容易发生水解。这种靶向试剂与肿瘤的表面抗原结合后，会进入溶酶体，在酸性环境下释放药物，而杀死肿瘤细胞。3）药物通过大分子与抗体相连