仪器分析第三章 HPLC.ppt

10生技《仪器分析》（11~12学年二学期）0/15第三章高效液相色谱法目录第三章高效液相色谱法......................................03.1概述........................................................13.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素..........13.3HPLC的主要类型及其分离原理..............23.4液相色谱法固定相...................................53.5液相色谱法流动相...................................63.6高效液相色谱仪.....................................63.7高效液相色谱分离类型的选择.............103.9液相制备色谱......................................113.10毛细管电泳（CE）........................1110生技《仪器分析》（11~12学年二学期）1/15本章基本要求1.熟悉高效液相色谱仪的一般结构流程和主要部件；掌握高效液相色谱仪常用检测器的原理及特性；2.掌握液相色谱的各种分离机理及适用对象；3.熟悉高效液相色谱法色谱条件的选择；4.熟悉毛细管电泳基本原理和主要方法。3.1概述高效液相色谱是20世纪60年代末70年代初发展起来的；在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论；技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器；具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点；可用来作液固吸附、液液分配、离子交换和空间排阻色谱（凝胶渗透色谱）分析及制备，应用广泛。与GC相比：HPLC可分析占有机物总数近80％的高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质。HPLC流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数。HPLC可在室温条件下工作。与经典液相色谱法相比:具有高速、高效、高灵敏度的特点。（参看P.66）3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素液相色谱法的流动相为液体。液体与气体在扩散系数、粘度、密度等物理性质方面差别较大。影响峰扩展的主要物理性质：涡流扩散项He：与GC相同。纵向扩散项Hd：分子在液体中的扩散系数比在气体中要小4--5个数量级，在流动相的u大于0.5cm.s-1时，对色谱峰扩展的影响实际上可以忽略。传质阻力项：由固定相传质阻力项Hs和流动相传质阻力项Hm和静态流动相传质本章基本要求3.1概述与GC相比：与经典液相色谱法相比:3.2影响色谱峰扩展及色谱分离的因素参数气体液体扩散系数D/cm2.s-110-110-5密度ρ/g.cm-310-31粘度η/g.(cm.s)-110-410-210生技《仪器分析》（11~12学年二学期）2/15阻力项Hsm组成。固定相颗粒大小、均匀度、固定液层厚度等均有影响。要提高液相色谱分离的效率：必须提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度以加快传质速率。选用低粘度的流动相，或适当提高柱温以降低流动相粘度，都有利于提高传质速率，但提高柱温将降低色谱峰分辨率。降低流动相流速可降低传质阻力项的影响，但又会使纵向扩散增加并延长分析时间。柱外展宽：色谱柱外各因素引起的展宽。柱前展宽柱后展宽3.3HPLC的主要类型及其分离原理3.3.1液-液分配色谱法（LLPC）液-液色谱法分配色谱法1．分离机制根据物质在两种互不相溶（或部分互溶）的液体中溶解度的不同，有不同的分配，实现分离。分配系数较大的组分，保留值较大。2．固定相载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失3．分配色谱分类正相色谱——固定液极性流动相极性极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分(如左式)3.3HPLC的主要类型及其分离原理3.3.1液-液分配色谱法（LLPC）1．分离机制2．固定相3．分配色谱分类正相色谱根据分离机制的不同液液色谱法液固色谱法离子交换色谱法离子对色谱法离子色谱法空间排阻色谱法……uDdcDdcDdcuDcd2Hs2fsm2psmm2pmmdp10生技《仪器分析》（11~12学年二学期）3/15反相色谱——固定液极性流动相极性极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分4、化学键合固定相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面（1）正相键合相使用极性键合固定相（2）反相键合相使用非极性键合固定相特点：固定液不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱3.3.2液-固色谱法（LSC）吸附色谱法液固吸附色谱法当试样分子(X）被流动相带入柱内时，它与流动相中溶剂分子（S）在吸附剂表面发生竞争吸附：X流动+nS吸附=X吸附+nS流动k为吸附平衡系数流动相为液体，固定相为固体吸附剂1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异k值大的强极性组分易被吸附，保留值大，k值小的弱极性组分难被吸附，保留值小。2．固定相：（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶（无定形和球形）堆积硅珠特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物（2）高分子多孔小球：原理：吸附+分配，兼小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物3.3.3离子交换色谱法（IEC）用能交换离子的材料作为固定相，利用它与流动相中试样离子进行可逆的离子交换来分离离子型化合物的方法。凡在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子色谱法进行分离。阳离子交换:M+溶剂+（树脂—SO3-Na+)≒Na+溶剂+（树脂—SO3-M+)阴离子交换:X-溶剂+（树脂—R4N+Cl-)≒Cl-溶剂+（树脂—R4N+X-)一般形式R-A+B≒R-B+A以浓度表示的平衡常数（离子交换反应的选择性系数）为：反相色谱4、化学键合固定相（1）正相键合相（2）反相键合相3.3.2液-固色谱法（LSC）1．分离机制：2．固定相3.3.3离子交换色谱法（IEC）nnSXSXK吸附流动流动吸附RRABABABK/10生技《仪器分析》（11~12学年二学期）4/15KB/A表示试样离子B对于A型树脂亲和力的大小。KB/A大，B离子就越易于保留而难于洗脱。[A]R、[B]R为树脂相中洗脱剂离子(A)和试样离子(B)的浓度，[A]、［B］为溶液中的浓度。试样离子(B)在两相间的分配系数(D)为：一般说来，A的浓度在树脂相和流动相中都远远大于试样离子（B）的浓度，而且基本上可以认为恒定。因此，D近似为常数。B离子电荷越大，水合离子半径越小，其KB/A就越大。3.3.4离子对色谱(IPC)将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水性离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。三种理论：离子对形成机理离子交换机理离子相互作用机理离子对形成机理：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，并在其中加入一种电荷与组分离子A-相反的离子B+,由于静电引力A-和B+生成离子对化合物A-B+。A-水相+B+水相=A-B+有机相固定相为有机相，流动相为水溶液，构成反相离子对色谱。固定相为极性，流动相为有机相，构成正相离子对色谱。最常用的是反相离子对色谱。离子对化合物A-B+具有疏水性，可被非极性固定相（有机相）提取。组分离子的性质不同，它与反离子形成离子对的能力大小不同以及形成的离子对疏水性质不同，导致各组分离子在固定相中滞留时间不同（出峰先后不同）。最常用的是反相离子对色谱。此法操作简便，柱效高，只要改变流动相的pH值、平衡离子的浓度和种类，就可在较大范围内改变分离的选择性，可同时分离离子性和中性化合物，能较好解决难分离混合物的分离问题。3.3.5离子色谱法（IC）由经典离子交换色谱法派生出来的。离子交换色谱法若采用电导检测器，会产生由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测的情况。1975年small等人提出一种新技术。在离子交换分离柱后加一根抑制柱。抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂，通过分离柱后的样品再经过抑制柱使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。若样品为阳离子M+，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经分离柱后进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：R+—OH-＋H+Cl-→R+—Cl-＋H2OR+—OH-＋M+Cl-→M+OH-＋R+—Cl-1)大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。3.3.4离子对色谱(IPC)固定相为有机相，流动相为水溶液，构成反相离子对色谱。固定相为极性，流动相为有机相，构成正相离子对色谱。3.3.5离子色谱法（IC）AAKBBDRABRB/10生技《仪器分析》（11~12学年二学期）5/152)将样品阳离子M+转变成相应的碱。由于OH-离子的淌度为Cl-离子的=2.6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。在分离柱后加一个抑制柱的离子色谱亦称为抑制型离子色谱或称双柱离子色谱。弱点：抑制柱要定期再生；谱带在通过抑制柱后会加宽，降低了分离度。不采用抑制柱的离子色谱体系，而采用了电导率极低的溶液，例如用1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸盐或邻苯二甲酸盐的稀溶液作流动相，称为非抑制型离子色谱或单柱离子色谱。3.3.6空间排阻色谱法（SEC）凝胶色谱法、凝胶过滤色谱(GFC)，凝胶渗透色谱(GPC)、尺寸排阻色谱法固定相为化学惰性多孔物质──凝胶，不具有吸附、分配和离子交换作用。凝胶的孔径与被分离组分分子大小相应。当试样中大小不同的组分分子随流动相经过凝胶颗粒时，它们渗入凝胶微孔的程度不同。试样中的各组分按照分子大小顺序洗脱。大分子受排阻不能进入微孔，分子越小则进入微孔越深，因而滞留时间不同。特点：排阻色谱法的试样峰全部在溶剂的保留时间前出峰。它们在柱内停留时间短，峰扩展小，所得峰较窄。固定相和流动相的选择简便。适用于分离相对分子质量为100至8x105的在流动相中可溶的化合物。只能分离相对分子质量差别在10％以上的分子。3.4液相色谱法固定相不同的方法，固定相不一样。抑制型离子色谱非抑制型离子色谱3.3.6空间排阻色谱法（SEC）3.4液相色谱法固定相(如左图))LLPCIPC全多孔型担体表层多孔（薄壳）型担体化学键合固定相SEC软质凝胶半硬质凝胶硬质凝胶LSC全多孔型担体薄壳型担体10生技《仪器分析》（11~12学年二学期）6/153.5液相色谱法流动相又称为洗脱剂。当固定相选定时，流动相的种类、配比能显著地影响分离效果。选择流动相应注意：（P.79）1)流动相纯度；2)应避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂；3)对试样要有适宜的溶解度；4)尽量使用低粘度的溶剂；5)流动相应与检测器相匹配。为了获得合适的溶剂强度（极性），常采用二元或多元组合的溶剂系统作为流动相。流动相中底剂和洗脱剂的组合选择直接影响分离效率。3.6高效液相色谱仪主要部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。辅助装置：梯度淋洗，自动进样及数据处理等。3.6.1高压输液系统3.5液相色谱法流动相(如左图)3.6高效液相色谱仪高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统IEC薄膜型离子交换树脂离子交换键合固定相溶剂底剂决定基本的色谱分离情况洗脱剂起调节试样组分的滞留并对某几个组分具有选择性的分离作用10生技《仪器分析》（11~12学年二学期）7/153.6.1高压输液泵(恒压泵恒流泵)由储液罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。3.6.2梯度洗脱装置内梯度:又称高压梯度。利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。外梯度:又称低压梯度。通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。梯度洗提：就是载液中含有两种(或更多)不同极性的溶