第14章 基因工程与蛋白质工程

基因工程与蛋白质工程第一节生物工程概述生物工程bioengineering，一般认为是以生物学(特别是其中的微生物学、遗传学、生物化学和细胞学)的理论和技术为基础，结合化工、机械、电子计算机等现代工程技术，充分运用分子生物学的最新成就，自觉地操纵遗传物质，定向地改造生物或其功能，短期内创造出具有超远缘性状的新物种，再通过合适的生物反应器对这类“工程菌”或“工程细胞株”进行大规模的培养，以生产大量有用代谢产物或发挥它们独特生理功能一门新兴技术。生物工程包括五大工程，即遗传工程(基因工程)、细胞工程、微生物工程(发酵工程)、酶工程(生化工程)和生物反应器工程。在这五大领域中，前两者作用是将常规菌(或动植物细胞株)作为特定遗传物质受体，使它们获得外来基因，成为能表达超远缘性状的新物种——“工程菌”或“工程细胞株”。后三者的作用则是这一有巨大潜在价值的新物种创造良好的生长与繁殖条件，进行大规模的培养，以充分发挥其内在潜力，为人们提供巨大的经济效益和社会效益。1.基因工程——在分子水平的遗传操作技术2.细胞工程——遗传物质在细胞间的转移4.生化工程——生物工程产品的最终取得手段3.酶工程——酶的改造和设计1基因工程基因工程（geneticengineering)是生物工程的主体和核心。它是指对不同生物的遗传物质（基因），在体外人工“剪切、组合、拼接”，使遗传物质重新组合，然后通过载体，转入微生物或高等生物细胞内，进行无性繁殖，并使所需要的基因在细胞内表达，产生出人类所需要的新产品，或创建新的生物类型。主要涉及DNA的复制、转录和表达，是分子水平上的操作技术，所以是分子水平上的生物工程。2细胞工程是在细胞水平和亚细胞水平的生物工程。重组细胞的结构和内含物，以改变生物的结构和功能。包括细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞大规模培养快速繁殖技术和细胞克隆技术。3酶工程：包括酶的开发与生产、酶的固定化和酶的分子改造与新酶研制等技术。4生化工程：包括生物反应器的设计、传感器的研制和产品的分离、精制技术。该反应体系如果用于微生物发酵，即为发酵工程。（不同于传统的发酵），是工程菌的大规模发酵技术。二、生物工程在现代工、农、医领域中的应用1.化工及冶金工业2.轻工和食品工业4.农业和畜牧业3.医药工业5.环保和能源工业第二节基因工程一、目的基因的获得二、基因载体三、重组DNA的筛选及表达一基因工程的概念定义：又称为DNA重组技术，指将某些特定的基因或DNA片断，通过载体或其它手段送入受体细胞，使它们在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。目的:是生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并能稳定遗传。重要特征：1、可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，可以任意改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状。2、某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为制备大量纯化的DNA片段提供了可能。转基因西瓜叶中银杏内脂GA含量达到32.6mg/g，相当于银杏叶中内脂含量的80%选育的三个康乃馨新品种已经在日本农林渔业部注册，2002年已产经济效益，其它几个新品种正在申请注册。部分品种已在欧洲推广。总的经济效益预计可达100亿日圆。对比：左图62.5g/100粒右图21.6g/100粒大豆转基因与非转基因大豆2000年10月2日出生的小猴“安迪”：安迪体内增加的基因仅是一个简单的标志基因，目的就是能够简单地确认出它的基因图谱。但是同样的转基因方法可以令其它的实验动物携带特定的医疗目的基因。2004年制造出世界上第一只转基因蝴蝶。有意思的是，这只蝴蝶的一些基因是来自水母的。不含胆固醇的小鼠胆固醇的确是我们生命中的一个重要组成部份。细胞膜中充满着胆固醇，性激素是经过酶修饰的类固醇，发育过程中的胚胎生长也依赖胆固醇。2006年12月22日中国首例转基因克隆猪一种特殊水母中提取绿色荧光蛋白基因，然后把该基因经过处理后转移到培养的猪胎儿成纤维细胞的基因组中，再把转基因体细胞的细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中构建成转基因胚胎。转基因胚胎经过手术移植入受体母猪，经过114天的发育，最终获得绿色荧光蛋白转基因克隆猪。基因工程的基本操作（1）获得目的基因和载体（2）切割、连接形成新的重组DNA分子（3）重组DNA分子导入受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传（4）对转化子筛选和鉴定（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物基因工程的操作流程一、目的基因的获得1.限制酶——特异性切割DNA的手术刀2.取得目的基因的方法——分离法及合成法1.限制性内切酶DNA重组即是将两种DNA分子经过切割，选择适合的片段连接起来的过程实现这一步，是在限制性内切酶发现以后才实现的。限制性内切酶：一类核酸内切酶，可以将外源DNA在特定位点切割降解。以后从细菌中分别分离出了I型和Ⅱ型两类限制性内切酶。限制性内切酶的命名用细菌同名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）构成酶的基本名称。若酶是从其中一种特殊菌株来，还在基本名称后加上菌株名称符号。名称后的罗马数字，表示在该特殊菌株中发现此酶的先后次序。如HaeII是从（Haemophilusaegypticus）中提取的，并且是从中发现的第二个酶。限制性内切酶切割DNA的方式a.从识别序列的中间切开b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割c.在识别序列对称轴的右边（5’-3’链）和对称轴左边（3’-5’链）切开a.从识别序列的中间切开从识别序列的中间切开产生平齐末端（bluntends），如HaeⅢGGGGCCCC3'5'5'3'5'3'b.在识别序列对称轴的左右两方进行切割即分别在5’-3’链和3’-5’链对称轴的左右方切开，形成带有凸出的5’磷酸基团的粘性末端（Cohesiveends），如EcoRⅠCTTAAAATTCGG5'3'3'5'c.在识别序列对称轴的右边（5’-3’链）和对称轴左边（3’-5’链）切开形成带有凸出的3’羟基的粘性末端，如pstICTGCAGACGTC3'5'G5'3'2.取得目的基因的方法——分离法及合成法（1）DNA片段的直接提取（2）用噬菌体或质粒直接从宿主细胞中将目的基因携出（3）使用相应的mRNA分离基因二、基因载体1.质粒——染色体以外的遗传单元2.噬菌体——感染细菌的病毒载体特点：①在宿主细胞中能独立自主的复制②携带易于筛选的选择标记③含有多种限制性内切酶的单一识别序列④除非必要序列外，载体尽可能小，便于导入细胞和进行繁殖⑤使用安全质粒载体、噬菌体、柯斯质粒、病毒载体及酵母人工染色体质粒是一种环状双链的DNA分子。自身在细菌细胞中能不断复制繁殖。研究比较深入的质粒有大肠杆菌的性因子（F因子）、大肠杆菌素因子和抗药因子等抗药因子（质粒）在其DNA上编码有某些酶的基因，表达产生的酶对链霉素、氯霉素、磺胺、青霉素、四环素、卡那霉素等药物能产生生物化学修饰，使之钝化而失效。1.质粒——染色体以外的遗传单元细菌、酵母菌、放线菌中的“染色体”以外的双链闭合环状DNA分子大小为1-200Kb松弛型严紧型质粒的作用质粒DNA能从细菌中提出来，又能再转入细菌。这个过程称转化。转入的质粒DNA仍能进行复制，这种性能为DNA重组技术提供了重要的条件，即将一种外源基因与质粒重组后，再转入细菌中去复制繁殖，使外源基因得以增殖。质粒自身的某些抗药基因成为从转化的细菌中筛选它们的一种标记。除质粒外，噬菌体、病毒也能通过“感染”将外源基因带入细菌并进行复制。目前所使用的质粒目前实验中所使用的质粒、噬菌体和病毒载体种类很多。但都是经过了人工改造，更适宜运用于DNA重组技术。它们既保留了转化和感染活细胞的能力，又具有多处携带外源DNA的酶切位点，并含有特殊的筛选标记。这些载体中有些只能复制扩增带入的外源基因；有些可以使外源基因复制、转录和翻译出基因的蛋白质产物，这种载体称为表达载体。pBR322质粒的结构以噬菌体或病毒为载体，将所需基因或含有此基因的DNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导。我们常常采用噬菌体作为基因工程的载体，其一它的遗传结构与功能知道得比较清楚；其二是易于使细胞感染，易于使外源DNA导入宿主细胞。2.噬菌体——感染细菌的病毒以噬菌体为载体进行DNA克隆DNA用限制性内切酶除去中间一段与外源DNA连接重组载体的体外包装带有外源DNA的噬菌体太小不能被包装头部前体多联体DNAA蛋白COSCOSCOS成熟的颗粒在宿主细胞内进行DNA的装配过程YAC载体可插入200-500Kb有端粒、着丝点及复制起始等功能序列，可导入酵母细胞，随细胞分裂复制繁殖。三、重组DNA的筛选及表达1.转化——带有目的基因的载体进入受体细胞2.筛选——从大量受体细胞选出带有重组体的细胞3.表达——外源DNA在受体细胞的转录和翻译1.转化——带有目的基因的载体进入受体细胞由质粒作载体形成的克隆，转入细菌时细菌预先要在低温条件下用氯化钙处理，形成“感受态”细胞。即增加细胞膜的通透性才能实现转化。由噬菌体作载体的克隆，转入细胞的过程称为“侵染”。因噬菌体具有自动侵入的功能。细菌不用预先处理。噬菌体感染大肠杆菌的途径+要插入的外来DNA质粒载体连接重组DNA分子经转化或病毒感染导入宿主细胞对含有重组DNA分子的选择无性繁殖（克隆）重组DNA分子合成和克隆过程宿主染色体2.筛选——从大量受体细胞选出带有重组体的细胞（1）插入失活法（2）放射性探针检测法（3）R-环检测法（4）免疫测定法（1）插入失活法在现在的基因工程操作中，所使用的载体通常是经过加工改造的衍生物，它们要么带有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具有被选择的遗传功能，这就使带有目的基因与不带目的基因的细菌有明显区别，便于筛选。pBR322质粒结构如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活如果外源DNA插入，四环素抗性基因失活（2）放射性探针检测法利用mRNA可与相应的DNA段落杂交，来检测有外源DNA插入的重组体，是一种快速而灵敏的方法。（3）R-环检测法在有利于形成R-环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA，在含有mRNA的缓冲液中局部变性。如若质粒DNA存在着与mRNA探针互补的序列，mRNA就会取代DNA中一条链，与另一条链形成双链杂交分子，从而形成R-环结构，在电子显微镜下观察，可直接观察到R-环。这样可检出重组体质粒DNA。（4）免疫测定法免疫法测定只能是所转移外源DNA必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。Southern和Western印迹法DNAfrangmentElectrophoresisTransferofDNAbyblotting32P-labledDNAprobeAutoradiographyAgarrosegelAutoradiogramNitrocellulosesheetAutoradiogramPolymersheetSDS-PolyacrylamidegelTransferproteinAddradiolabledspesficantibody,WashtoremoveunboudantibodyProteinbanddetectedbyspecificantibodyAutoradiography3.表达——外源DNA在受体细胞中的转录和翻译带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肽。第三节蛋白质工程一、蛋白质工程的概念二、蛋白质工程的一般技术三、蛋白质工程的应用一、蛋白质工程的概念蛋白质工程(proteinengineering)：通过改造与蛋白质相应的基因中的碱基顺序，或设计合成新的基因，将它克隆至受体细胞中，通过基因表达而获得具有新的特性的蛋白质技术1、基因定点突变——定做新蛋白质2、蛋白质设计——对天然蛋白质的修饰蛋白质工程举例：定点突变技术：已知丝氨酸是由TCT编码，只要把C改为G，就变成半胱氨酸的密码TGT。于是用人工合成一段寡聚核苷酸引物，