发酵工程原理与技术应用复习题 四川理工学院

微生物工程：利用微生物的活动来进行物质转化的理论与工程技术体系。根据微生物对氧的需求情况：好氧发酵、厌氧发酵、兼性厌氧；根据培养基性状：液体发酵、固体发酵；根据工艺流程：分批发酵、连续发酵；微生物发酵培养（过程）方法主要有分批培养、补料分批培养、连续培养、半连续培养四种。发酵工业对菌种的要求①培养基原料来源广、廉价；②培养条件易控制；③发酵周期短；④菌株高产；⑤抗病毒（噬菌体）能力强；⑥菌株性状稳定，不易变异退化；⑦菌体本身不能是病原菌；发酵工业菌种的分离筛选典型步骤：样品采集→样品预处理→目标菌富集→初筛→复筛→发酵性能测试→菌种鉴定→菌种保藏；富集培养：目的就是让目的菌在种群中占优势，使筛选变得可能。（使混合微生物群体中某特定微生物比例激增的培养方法。）标本的预处理：优化目标菌生长环境物理方法、化学方法、诱饵法菌种分离：通过稀释平板、平板划线、平板涂布等手段获得单菌落，再进一步获得纯化菌种。工业化生产对菌种的要求？a能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物b有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强c遗传性能要相对稳定d不易感染它种微生物或噬菌体e产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）f生产特性要符合工艺要求；代谢调控机制：酶活成的调节(诱导、阻遏)；酶活性的调节(激活、抑制)育种方法：常规育种、细胞工程、基于代谢调节的育种、基因工程、蛋白质工程、代谢工程等。常规育种方法中，包括自然选育、诱变育种；杂交类型：接合准性杂交有性杂交原生质体融合转化转导细菌，霉菌，酵母菌杂交育种：接合准性杂交主要是有性杂交;细胞工程育种包括杂交育种、原生质体融合；常用工业微生物可分为：细菌、酵母菌、霉菌、放线菌四大类。发酵高产菌种选育方法包括（自然选育）、（杂交育种）、（诱变育种）、（基因工程育种）、（原生质体融合）。菌种选育分子改造的目的？防止菌种退化;解决生产实际问题;提高生产能力;提高产品质量;开发新产品.自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。自然选育在工业生产上的意义：自然选育可以有效地用于高性能突变株的分离。然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。自然选育操作步骤：单细胞(孢子)悬液的制备平板分离挑选单菌落(注意形态的观察)发酵试验;生产上所不希望看到的，表现为菌株的衰退和生产质量的下降，这种突变成为负突变。生产上希望看到的，对生产有利，这种突变成为正突变。结构类似物：在化学和空间结构上和代谢的中间物（终产物）相似，因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物（终产物）的功能，但细胞不能以其作为自身的营养物质。回复突变：高产菌株在传代的过程中，由于自然突变导致高产性状的丢失，生产性能下降，这种情况我们称为回复突变初级代谢产物是指微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢，生成维持生命活动所需要的物质和能量的过程。这一过程的产物即为初级代谢产物。次级代谢产物是指微生物在一定生长时期，以初级代谢产物为前体物质，合成一些对微生物的生命活动无明确功能的物质过程，这一过程的产物，即为次级代谢产物。用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种.诱变育种的目的？提高有限产物的产量；改善菌种特性；开发新产品；诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂;物理诱变剂：射线如紫外线、X-射线、γ-射线，快中子；物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外线。化学诱变剂：化学因子如碱基类似物、5-氟尿嘧啶、烷化剂等。化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂（亚硝酸和烷化剂应用的范围较广，造成的遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”，甲基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。）大部分诱变剂是致癌剂或极毒药品，所以在使用中必须非常谨慎，要避免化学诱变剂与皮肤接触，且切勿吸入其蒸气，不仅要注意自身安全，还要防止污染环境，造成公害。诱变育种步骤：出发菌株的选择；处理菌悬液的制备；诱变处理；中间培养；分离和筛选；原生质体融合育种步骤：1.菌株标记菌株的筛选和稳定性验证2.制备原生质体制备。3.融合等量原生质体加聚乙二醇促进融合。4.再生涂布于再生培养基，再生出菌落。5.融合子检出选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏。6.测试生产性能筛选。影响原生质体制备的因素：1.菌体的前处理2.菌体的培养时间3.酶浓度4.酶处理温度5.破壁时的pH值6.渗透压稳定剂；能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基；在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基；能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基，如牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基等。筛选营养缺陷型的步骤：诱变；淘汰野生型（抗生素法；菌丝过滤法）；检出缺陷型（影印法；点种法；夹层法）；确定生长谱；菌种保藏目的：①存活，不丢失，不污染；②防止优良性状丢失；③随时为生产、科研提供优良菌种。基本原理：根据菌种的生理生化特点，人工地创造条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。常用的菌种保藏方法：斜面低温保藏法、石蜡油封保藏法、砂土保藏法、硅胶保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法等。衰退的可能原因：基因突变连续传代采用不适宜的培养和保藏方法；防止菌种衰退的方法①尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素影响；②尽量减少转代次数；③采用幼龄菌种；菌种复壮方法①分离复壮；②若单菌落分离不行，可改变培养条件，或两者结合进行复壮；③诱变因素处理，再进行单菌落分离；工业培养基定义：人工配制的提供微生物或动植物细胞生长、繁殖、代谢和生物合成各种代谢产物所需的按一定比例配制的多种营养物质的混合物和原料。培养基的成分及来源：一.碳源二.氮源三.无机元素四.生长因子五.前体六.促进剂和诱导剂七.消泡剂八.酸、碱发酵工业培养基的基本要求？（1）必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分；（2）原料价格低廉，质量稳定，取材容易；（3）有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期；（4）尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化；尽可能减少产生“三废”物质（5）所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，提高氧的利用率。降低能耗6）有利于减少培养基原料的单耗即提高单位营养物质的转化（7）有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。碳源：凡是用于构成微生物细胞和代谢产物中碳元素的营养物质均称为碳源。1.功能⑴为细胞生长和产物合成提供碳元素⑵为细胞生长、繁殖和维系生命提供能量ATP。2.种类:糖类、醇类、有机酸及盐类、油脂类、烃类。发酵工业上常用的糖类主要有：葡萄糖糖蜜淀粉；（葡萄糖效应：过多葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致培养基中的溶解氧不能满足需要，使一些中间代谢产物如丙酮酸，乳酸，乙酸等不能完全氧化而积累在菌体或培养基中，导致PH下降，影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成）氮源功能：为细胞生长和产物合成提供氮元素。常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨等；常用的无机氮源有氨水、铵盐和硝酸盐。有机氮源在发酵培养基中的作用有：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。诱导某些酶的产生。尿素及有机氮：一般无毒，但尿素使PH↑，灭菌后不稳定造成尿素减少。另有机氮源同时含有C、N，故兼有C、N的作用。生理酸性物质：经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源。生理碱性物质：经微生物生理作用后能形成碱性物质的无机氮源。氨水：碱性强、易挥发、不能加热灭菌，不能加到基础培养基中，只用于流加,且要搅拌。生长因子：凡是微生物生长不可缺少的微量有机物，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称为生长因子。功能：构成细胞组分，促进生命活动进行。前体指某些化合物加入发酵培养基中，能直接被微生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。⑴功能：直接构成代谢产物的一部分⑵特点：有些前体浓度过高对菌体产生毒性。菌体还具有将前体氧化分解的能力，故需工艺控制。少量流加多次加入加入的时间；促进剂或诱导剂对产物的合成有促进或诱导产物的合成；消沫剂：合成消沫剂、动植物油脂；根据工艺要求1.孢子培养基：收获孢子2.种子培养基：繁殖微生物菌丝体或细胞3.发酵培养基：大量菌体或代谢产物4.补料培养基：补充营养；微生物的培养基根据生产用途只要分为孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。培养基质量的判断标准：⑴有效成分的含量⑵色泽⑶pH值⑷有无杂菌；影响因素：⑴原材料的质量纯度、原材料的产地品种、加工方法、储存条件、粉碎粒度等。⑵配制方法；培养基的配方中应注明的事项：①计料体积与配料体积的关系②物料的规格③pH值及调整方法④对配制水的要求⑤投料的顺序；讨论：培养基优化在发酵优化控制中的作用与地位？发酵优化控制分两个阶段：第一阶段控制菌体的生长，目的是使长好的菌体能处在最佳的产物合成状态。培养基优化应该保证菌体快速生长，有利于产物合成和分泌的酶系开启，而不利于产物合成酶系的关闭，处于最佳的产物合成状态，并且副产物合成和分泌的酶系尽可能的少开启第二阶段控控制产物的合成。该阶段，培养基优化应使产物合成能较长时间保持在最大合成速度。副产物的的合成速率尽可能小。产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。灭菌指利用物理、化学的方法杀灭或除去物料及设备中一切生命物质的过程。一般衡量灭菌彻底与否，是以能否杀死芽孢细菌为标准。消毒是指用物理或化学的方法杀死物料、容器、器具内外的病源微生物，一般只能杀死营养细胞而不能杀死芽孢；不同污染时期对发酵的影响：a种子培养期菌浓低，营养丰富；灭菌倒种；B发酵前期杂菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成；灭菌，重接种；C发酵中期严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成；并罐、提前放罐等；D发酵后期如杂菌量不大，可继续发酵；如污染严重，可采取措施发酵控制提前放罐；染菌后对设备的处理：彻底灭菌；种子带菌及防止：带菌的原因：无菌室的无菌条件不符合要求；培养基灭菌不彻底；操作不当。种子带菌的防止：种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板、肉汤培养，借以说明是否是种子中带杂菌。严格技术规范种子培养的设备和装置；灭菌的方法有：干热灭菌法，湿热灭菌法，火焰灭菌法，电磁波、射线灭菌法，化学药品灭菌法及过滤除菌法。环境无菌的检测方法有：显微镜检查法、肉汤培养法、平板培养法、发酵过程的异常观察法等。微生物的热阻：表征不同微生物对热抵抗能力强弱的指标。指微生物在某一特定条件(主要是温度和加热方式)下的致死时间。杀死微生物的极限温度称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。相对热阻：指在相同条件下两种微生物热阻的比值。对数残留定律：微生物热死速率即微生物个数减少的速度与任一瞬间残存的菌数成正比。—dN。∕dt=K.N灭菌中，温度升高，菌体死灭速度的增加远大于营养成分被破坏的增加；这就是高温短时间灭菌的依据。(影响培养基灭菌的因素除了所污染杂菌的种类、数量、灭茵温度和时间外。培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响);比较分批灭菌与连续灭菌的优缺点。分批灭菌就是将配制好的培养基放入发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备进行一起灭菌的操作过程，也称实罐灭菌。分批灭菌不需要专门的灭菌设备，投资少，设备简单，灭菌效果可靠。分批灭菌对蒸汽的要求低，一般在（3~4）X105Pa（表压）就可满足要求，分批灭菌是中小型发酵罐常用的一种灭菌方法。(分批灭菌包括升温保温冷却三个阶段；灭菌主要是在保温过程中实现的，在升温的后期和冷却的初期，培养基的温度很高，因而对灭菌也有一定贡献)连续灭菌就是将配制好的培养基向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热保温和冷却等灭菌操作过程。连续灭菌时，培养基能在短时间内加热到保温温度，并能很快被冷却。因此可比在分批灭