实训指导-培养基的制备.

教育部高等职业教育护理专业教学资源1实训指导——培养基的制备【实验目的】1．掌握培养基制备的基本过程。2．熟悉常用培养基的原理、种类及其用途。【实验材料】1．试剂氯化钠、蛋白胨、琼脂粉、抗凝兔血、牛肉膏、1mol/LNaOH、1mol/LHCl。2．器材锥形瓶、量筒、吸管、精密pH试纸、无菌试管、硅胶塞、天平、高压蒸气锅、血清凝固器、脱脂棉、滤纸、漏斗、无菌平皿。【实验方法】1．培养基制备的基本过程包括调配成分、溶解、校正pH、澄清过滤、分装、灭菌、质量检查和保存。(1)调配成分：在锥形瓶或大容量烧瓶中，加定量蒸馏水，按培养基处方用量准确称取各种成分，使其充分混合。(2)溶解：将调配好的混合物在沸水浴中，使其完全溶解。(3)校正pH：一般将培养基的pH调至7.2~7.6左右。经高压灭菌后其pH可发生0.1~0.2变动。若用NaOH校正，高压蒸汽灭菌后pH下降0.1~0.2；若用NaCO3校正，高压蒸汽灭菌后pH升高0.1~0.2。(4)滤过澄清：自配的培养基通常有一些混浊或沉淀，需滤过澄清后方可使用。液体或半固体培养基常用滤纸过滤，固体培养基在熔化后趁热以绒布或双层纱布加脱脂棉过滤。(5)分装：①基础培养基：一般分装于容量为500ml锥形瓶灭菌后备用，以便随时分装倾注平板或配制营养培养基等；②琼脂斜面：通常在融化后分装于试管，量约为试管高度的1/4~1/3，加塞后灭菌，趁热摆成斜面，斜面长度约为试管长度的2/3，且保持试管下端有1cm柱高；③半固体培养基：分装量为试管容量的1/4~1/3，加塞灭菌后趁热直立凝固；④琼脂平板：先将灭菌琼脂融化后冷却至50℃左右，以无菌操作倾注于灭菌平皿内，待琼脂凝固后将平皿翻转，置4℃保存备用。教育部高等职业教育护理专业教学资源2(6)灭菌：①由耐热物质配制成的培养基(如普通营养琼脂等)常用高压蒸汽灭菌，条件为103.43kPa，15~20min；含糖培养基以68.95kPa，10~15min为宜，以免破坏糖类物质；②不耐高热的物质配制成的培养基，如糖类、明胶和牛乳等常用流通蒸汽灭菌，方法是加温80~100℃30min，每天1次，连续3天；③富含蛋白质的培养基(如含血清或鸡蛋清的培养基)需用血清凝固器灭菌，方法是将配制好的培养基摆放在血清凝固器内(一般做成斜面)，第1天75℃、30min，第2天80℃、30min，第3天85℃、30min，在3次灭菌的间隙将培养基取出，置35℃孵箱中过夜；④对高营养液态的不耐热培养基，如血清、细胞培养液等，则可用滤过除菌。(7)质量检验：需做无菌试验和效果试验。①无菌试验：将灭菌后的培养基置37℃孵育24h，无任何细菌生长为合格；②效果试验：将已知的标准参考菌株接种于待检培养基中，检查细菌的生长繁殖状况和生化反应是否与预期的结果相符合。(8)保存：制备好的培养基应注明名称、制作日期；用牛皮纸包裹或装于保鲜袋内，以减少水分蒸发。液体培养基应直立放置。制作好的培养基应存放于冷暗处或4℃冰箱。2．常用培养基的制备(1)肉膏汤：蒸馏水1000ml置锥形瓶或大容量烧杯中，将牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl5g加入水中，加热熔解后校正pH至7.6，煮沸3~5min，过滤后分装，103.4kPa、20min高压蒸气灭菌后，4℃贮存。供作无糖基础培养基用。适用于营养要求一般的细菌。(2)普通琼脂(营养琼脂)：将肉汤或肉膏汤1000ml、琼脂20g混合，加热融化，趁热分装于试管或锥形瓶，加塞后103.4kPa、20min高压蒸汽灭菌，取出试管摆成斜面，待琼脂凝固后即成琼脂斜面；锥形瓶中的琼脂冷至50℃左右倾注灭菌平皿，凝固后即成普通琼脂平板。(3)半固体培养基：将肉汤或肉膏汤1000ml、琼脂5g混合，加热融化后分装小试管，每管2ml，103.43kPa、20min高压蒸汽灭菌，取出后直立待凝即成。可作观察细菌动力和保存菌种用。(4)血液和巧克力琼脂培养基：将灭菌后的普通琼脂培养基(pH7.6)加热融化，教育部高等职业教育护理专业教学资源3冷至50℃左右，以无菌操作加入10％无菌脱纤维兔血(临用前置37℃水浴预温30min)，轻轻摇匀(避免产生气泡)，分装于无菌试管和平皿内，凝固后即成血琼脂斜面和血琼脂平板。若琼脂温度在70~80℃时加入血液，并在80℃水浴中摇匀15~20min，倾注平板后即成巧克力琼脂平板。【注意事项】1．培养基调配溶解先在锥形瓶底加入少量水，再加入蛋白胨等成分，以防其粘瓶底烧结。制备大量培养基，除玻璃容器外，还可用铝锅、搪瓷桶，但不可用铁、铜容器，以免铁、铜离子进入培养基；因培养基中含铁量超过0.14mg/L时可抑制细菌毒素的产生，含铜量超过0.3mg/L时可抑制细菌生长。需在培养基中加染料、胆盐、指示剂等，应在校正pH后加入。2．培养基的澄清如需要制备十分澄清的培养基，可用卵蛋白加热澄清法。其方法为：取一个蛋的卵蛋白加水20ml，搅拌至出现泡沫，倒人1000ml液体或熔化的固体培养基中混匀，然后在流动蒸汽中加热30~60min．使培养基中不溶性物质附着于凝固蛋白，取出后以纱布夹脱脂棉(固体培养基)或滤纸(液体或半固体培养基)过滤即可。3．平板的浇注倾注培养基时，切勿将皿盖全部开启，以免空气中尘埃及细菌等微生物的落入。倾注时若培养基温度过高，则冷凝水过多，易致污染，不易分离到菌落；若温度过低，部分琼脂凝固，倾注平板表面高低不平。可在无菌室或接种罩内倾注培养基后，将皿盖稍开一缝隙，在紫外灯照射下待凝，这样利于蒸汽散发，减少平板内冷凝水。倾注血液琼脂时，由于加血时琼脂表面容易产生气泡，倾注时适时转动锥形瓶，使气泡附于瓶壁，以减少血平板表面的气泡。【实验报告】培养基制备的基本过程和操作注意事项。