实验二 碱性磷酸酶的提取及其比活性测定

碱性磷酸酶的提取及其比活性测定带教:张学礼、戴薇薇龚张斌、黎志萍材料选择细胞的破碎分离纯化鉴定碱性磷酸酶(ALP,AKP)Alkalinephosphatase一、实验目的1、掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；2、掌握酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；3、了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。二、实验原理1、AKP概述①催化有机单磷酸酯水解，并有转移磷酸基的作用②最适pH：8.6～10.3③特点：特异性低④体内位置：细胞膜表面-肾小管的筛状缘-肠粘膜的微绒毛-胆小管的细胞膜缘-肝窦状腺表面-胎盘合体细胞滋养层细胞外表面⑤正常血清：ALP主要来自肝（或胆管）和骨骼，约各占总活性的一半。⑥临床意义：血清ALP活力增高常见于-肝胆疾病（胆道阻塞等）-骨骼疾病（佝偻病等）-甲状腺功能亢进-妊娠和生长期儿童2、AKP的分离、提取、及纯化整个制备过程可分为5个阶段：①材料的选择和预处理，②细胞的破碎，③提取，④纯化（包括盐析、有机溶剂提取、层析、电泳等），⑤浓缩、干燥及保存。①取材取酶含量丰富、容易提取、新鲜的组织本次实验：肝脏②生物组织与细胞的破碎机械破碎法：高速组织捣碎机、匀浆器、研钵渗透破碎法：低渗条件使细胞溶胀而破碎反复冻融法：超声波法：超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎酶法：如用溶菌酶破坏微生物细胞③选择合适分离提取方法把混在酶制剂中的大量杂蛋白及其它大分子物质（核酸、脂类、多糖）去除掉把酶从溶液中提取出来有机溶剂方法——有机溶剂分段沉淀法原理：利用不同的蛋白质在不同浓度的有机溶剂中有不同的溶解度而进行分离。有机溶剂：①正丁醇能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解在溶液中②乙醇30%AKP溶解状态60%AKP沉淀状态③丙酮33%AKP溶解状态50%AKP沉淀状态通过离心，去除部分杂蛋白通过离心，进一步去除杂蛋白④保护酶活性措施a.低温条件下操作b.所有试管均需洗干净c.选择合适的pH及合适的缓冲体系，以稳定酶活性Mg(Ac)2~NaAc混合液提取AKPpH8.8Tris缓冲液测AKP活性保护和稳定AKP2g新鲜兔肝剪碎→匀浆管加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液2ml，匀浆匀浆液入离心管用4ml上述混合液冲洗匀浆器，并倒入离心管，混匀，记体积VAA液A1管A2管剩余A液0.1mlA液+0.1mlA液+4.9ml0.01MpH8.8Tris4.9ml生理盐水三、操作步骤（待测酶活性）（待测蛋白质含量）加2ml正丁醇，搅拌3-5'，室温放置30'，过滤，入离心管上述滤液加等体积冷丙酮，混匀，离心2000rpm、5分钟上清入回收瓶沉淀加4.0ml0.5MMg(Ac)2,搅拌，记体积VBB液0.10mlB液+4.9ml0.01MpH8.8TrisB1管B2管剩余B液VB'0.1mlB液+4.9ml生理盐水加0.45VB'冷乙醇96%→30%，混匀，离心2500rpm,5分钟（待测酶活性）（待测蛋白质含量）上清弃沉淀入离心管，记体积VB‘’，加0.83VB‘’冷乙醇96%（30%→60%）混匀，离心2500rpm,5分钟上清入回收瓶沉淀加0.01MMg(Ac)2-0.01MNaAc混合液4ml，搅拌，记体积VcC液C1管C2管剩余C液Vc'0.10mlC液+1.9ml0.01MpH8.8Tris0.1mlC液+0.4ml生理盐水加0.5Vc'冷丙酮→33%，混匀,离心2000rpm,5分钟（待测酶活性）（待测蛋白质含量）上述离心结果上清弃沉淀上清入回收瓶沉淀加5ml0.01MpH8.8Tris，搅拌，记体积VDD液D1管D2管0.10mlD液+0.9ml0.01MpH8.8Tris入离心管，记体积Vc'',加1/3Vc''冷丙酮→50%，混匀，离心2000rpm,5分钟剩余D液（待测酶活性）（直接待测蛋白质含量）上述离心结果比活性：指单位质量的蛋白质制剂中所含的酶活性单位比活性=酶活性单位数/mg蛋白二、实验原理3、建立测定酶比活性的方法①②磷酸苯二钠法原理：磷酸苯二钠AKP苯酚K3Fe(CN)64-氨基-安替比林醌类化合物λ=510nm①测定酶活性AKP活性单位定义:37℃,反应15分钟,产生1ug苯酚一个AKP活性单位（u）试剂(ml)B1234A1稀释液0.10B1稀释液0.10C1稀释液0.10D1稀释液0.10pH8.8Tris缓冲液0.10复合基质液33333立即混匀。将各管置于37℃水浴精确保温15分钟0.5%K3Fe(CN)622222立即混匀。终止酶促反应，室温静置10分钟。H2O调零，λ=510nm比色，记录各管OD。计算酶活性：各制剂总AKP单位数（U）=查表所得值×稀释倍数×总体积注：A1、B1、C1、D液分别稀释50、50、20、10倍（标准曲线）考马斯亮蓝法（CoomassieBrilliantBlueG-250，Bradford法）考马斯亮蓝G-250——红色和蓝色酸性游离状态棕红色465nm+蛋白质蛋白质-染料复合物595nm②测定蛋白质含量试剂(ml)B1234生理盐水0.10A2稀释液0.10B2稀释液0.10C2稀释液0.10溶液D0.10考马斯亮兰试剂55555混匀。2分钟后，H2O调零，λ=595nm比色，记录各管OD。计算蛋白质含量：各制剂总蛋白含量（mg）=查表所得值×稀释倍数×总体积注：A2、B2、C2液分别稀释50、50、5倍③各制剂的比活性，得率及纯化倍数的计算1、AKP比活性：AKP比活性（U/mg）=每ml制剂中AKP活性单位数（U）每ml制剂中蛋白质含量（mg）2、得率得率=每一制剂中总的酶活性单位溶液A中总的酶活性单位×100%3、纯化倍数纯化倍数=每一制剂AKP比活性（U/mg）溶液A制剂AKP比活性（U/mg）匀浆A液第一次丙酮提取（B液）第二次乙醇提取（C液）第三次丙酮提取（D液）总体积（ml）蛋白含量（mg/ml）总蛋白量（mg）AKP活性单位（u/ml）总AKP活性单位（u）比活性（u/mg）纯化倍数得率AKP分离纯化小结表：有机溶剂体积的计算——96%乙醇VB/中加乙醇96%30%（VB/+VX）×30%=96%×VXVX=0.45VB/VB//中加乙醇（96%）从30%60%（VB//+VX）×60%-VB//×30%=96%×VXVX=5/6（0.83）VB//注意事项1.低温条件进行2.有机溶剂边加边搅拌3.加完有机溶剂后，立即离心，分析沉淀4.加有机溶剂的量计算精确5.乙醇上层液入回收瓶比色分析的原理有色溶液设：T(透光度)A=lg=-lg=-lgTIOIIIO(吸光度)IIO代表：有色物质对光的吸收能力入射光IO透过光ICLBeer定律：A∝C合并Lambert-Beer定律：A∝C•L即：A＝K•C•LLambert定律：A∝L摩尔吸光系数在同一实验条件下，分别测定待测物溶液吸光度（A测）和标准物溶液吸光度（A标），两者均符合Lambert-Beer定律。A测C测A标C标A测A标C测＝×C标稀释倍数×有A测=K测C测L测A标=K标C标L标因为K测=K标；L测=L标