第五章 植物细胞培养及原生质体培养

第五章园艺植物细胞工程技术园艺植物细胞工程是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的试验方法和技术，在细胞水平上研究改造园艺植物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或园艺植物新品种的技术。分为广义上的细胞工程和狭义上的细胞工程。广义上的细胞工程包括：植物组织和器官培养、细胞培养、原生质体培养和融合、亚细胞水平的操作等。狭义上的细胞工程是指细胞培养、原生质体培养及融合（体细胞杂交）、染色体操作及制作遗传转化受体等内容。第一节园艺植物细胞培养在一定条件下，通过人工供给营养物质及生长因子，使离体植物细胞生长繁殖的方法。细胞培养技术主要用于研究细胞生长、发育与分化等理论以及用于植物次生代谢物质生产。一、植物细胞培养(cellculture)的特性：1.植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差；2.细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素；3.细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达350um一400um的团块，悬浮培养较困难；4.培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有群体效应5.培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能全能性。1二、植物细胞培养的营养需求及培养基１.营养需求：植物细胞生长所需营养较微生物细胞复杂，除水分外，其它营养成分可分为如下几类：(1)无机营养:如N、P、K、Ca、Mg、Fe、Cu、Mn、Zn、B、Mo、I等；(2)维生素：如维生素B1、B6、烟酸、肌醇、生物素、泛酸钙及叶酸等；(3)碳源:如蔗糖、葡萄糖、木糖、甘露糖及山梨醇等；(4)天然物:如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰乳、酵母提取液、香蕉汁、荸荠汁、生梨汁及苹果汁等；(5)植物激素:如生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸；其它有油菜素内酯、三十烷醇、肽类、半支莲醇、月光花素、石蒜素、玉米素等；(6)氨基酸类:如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、组氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、苏氯酸、苏氨酸、酪氨酿、精氨酸、丙氨酸及半胱氨酸等；(7)核酸及其水解物:如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶等；(8)其它成分:如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等.2.培养基：(1)固体培养基：添加琼脂等(2)液体培养基：不加琼脂等三、植物细胞培养技术细胞培养技术主要包括单细胞培养（微室培养、平板培养、看护培养、悬滴培养、微滴培养）、悬浮培养、固相化培养等多种培养方式。1.单细胞培养：对分离的单细胞进行培养的方法。（1）单细胞的分离：A.从叶片直接分离：采用机械法（将叶片轻轻研碎、然后过滤和离心纯化）或酶解法（采用果胶酶处理叶片）由叶肉细胞分离。B.从愈伤组织分离：由离体组织获得愈伤组织，再由愈伤组织分离单细胞通过愈伤组织振荡培养、过滤和离心等步骤分离单细胞。单细胞培养方法：（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即可生长成团。（2）看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。（3）微室培养法：悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。（4）条件培养：是指采用条件培养基进行培养单细胞的方法，条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养，一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化，简单的方法是采用液体培养基培养4-6周高密度细胞过滤掉，制成液体或固体培养基接种单细胞。（5）纸桥培养：是用于植物茎尖分生组织细胞培养的方法，也可用于单细胞。是使滤纸的两端进入培养基，中央部分露出培养基表面，将所要培养的细胞置于滤纸上培养。（P80，图5-4）2.悬浮培养法：植物细胞悬浮培养(cellsuspensionculture)即植物细胞或小的细胞聚集体在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养，使之在体外生长和发育，并保持良好的分散性。特点：可以工厂化生产，提供大量一致的细胞悬浮细胞的来源：愈伤组织，某个器官或组织，甚至幼嫩的植株，通过物理或化学的方法进行分离而获得。(1)优良的悬浮细胞培养体系必需满足：A.悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。B.均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。C.生长迅速，悬浮细胞的量一般2—3天甚至更短时间便可增加一。(2)培养过程：将愈伤组织、无菌苗、吸涨胚胎或外植体芽尖、根尖及叶肉组织，经匀浆器破碎、不锈钢网过滤，单细胞滤液作为按种材料，接种于液体培养基中振荡培养。(3)悬浮培养特点：培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生物相同，有延滞期、对数生长期、直线生长期、减慢期及静止期等阶段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0.25xl0‘细胞／ml一0.5x10‘细胞／m1。细胞生长曲线(4)悬浮培养类型：A.分批培养(Batchculture)：分批培养是在一个封闭的系统中进行细胞培养。细胞材料生长在已固定体积的培养基中。随着细胞数量的增加，培养基营养的消耗及某些其他因子的积累会使细胞停止生长。继代培养需取出少量培养物转接于新鲜培养液中。生长过程包括延迟期、指数期、静止期等。分缓慢转动培养（1-2rpm）、震荡培养（100rpm）、快速转动培养（80-120rpm）和搅拌培养。B.连续培养(Continuousculture):是用一定容积的特定容器中进行细胞培养的方法，在培养过程中不断注入新鲜培养基，而使营养物连续得到补充，细胞生长和增殖连续进行，同时有等体积的培养物排除系统。分为封闭式连续培养和开放式连续培养。最大特点是细胞生长速率标准一致，新形成的细胞补偿了被排出的细胞，系统内细胞密度、生长速度、化学成分、细胞代谢活性都维持恒定。可通过改变培养基及培养条件建立恒定系统。化学恒化法：通过营养液或某一成分的含量进行控制。浊度恒定法：比浊计或分光光度计测定浑浊度而进行流量控制。C.半连续培养：利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式，当培养罐内细胞数量增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此反复进行再培养。半连续培养能够获得大量均匀一致的培养细胞。（5）悬浮培养细胞的同步化：同步化培养室之培养基中的大部分细胞都能同时通过细胞周期（G1、S、G2和M）的各个阶段。实现悬浮细胞同步化的方法有：A饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新加入该限制因子时，静止细胞就会同时进行分裂。B抑制法：使用DNA合成抑制剂，如5-氨基嘧啶等也可以使细胞同步化。由于核酸类似物的存在阻止了DNA的合成，细胞周期只能进行到G1期，细胞都滞留在G1或S期的边界，当去除抑制剂后，细胞就进入同步分裂。C.采用发酵器系统进行同步化：通过充入氮气的方法控制细胞分裂活力，然后恢复普通空气状态时再度分裂。（6）悬浮培养细胞的植株再生：悬浮培养细胞形成体细胞胚或诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织再生植株。（7）影响悬浮培养的因素：A培养基：通常需要高硝态氮和銨态氮，以及含磷量高的培养基。B.细胞密度：最低密度为0.5×105~1.0×105。C.植物激素和其他附加成分:添加适当浓度的激素和氨基酸。D.培养基pH值：通过调节营养比例或加入化学成分稳定pH值。E.CO2浓度：低密度培养中，CO2对于诱导细胞分裂有较大的影响，需控制适当浓度。3.固相化培养技术：细胞固定在一定的惰性基质中，如琼脂、海藻酸盐、聚丙烯酰氨纤维膜上，细胞不能运动，但营养液可以在基质中流动。（1）固相化培养的特点：A.消除剪切力；B.细胞生长缓慢，促进次生代谢过程；C.细胞之间紧密接触，形成梯度，利于产物积累；D.便于操作，不易污染。E.便于产物收集。第二节园艺植物原生质体培养通过一定方法除去细胞壁，而得到一个裸露的植物细胞，即为原生质体(Protoplast)。游离的原生质体在一定条件下培养可以重新形成细胞壁，并像正常的植物细胞那样具有全能性，经过适当的培养可以再生出完整植株。蝴蝶兰原生质体培养和植株再生（图片引自PlantCellReports，2007，26：719-725）非洲百合原生质体培养和植株再生（Agapanthuspraecox）（图片引自PlantCell,TissueandOrganCulture，2003，72（1）：63-69）球根鸢尾原生质体培养和植株再生（图片引自Euphytica，1999，105:99–102）针叶石竹叶片原生质体培养及植株再生（图片引自InVitroCell.Dev.Biol.—Plant2005,41:794–800）仙客来原生质体培养及体胚途径再生（图标引自PlantCellTissOrganCult,2010,101:171–182）一、原生质体培养的意义（1）原生质体可以作为体细胞无性系变异和突变体筛选的材料；（2）利用原生质体不具细胞壁的特性可以进行细胞器移植和外源物的摄取(病毒、微生物、外源遗传物质)；（3）原生质体之间可以进行融合而产生杂种细胞(即体细胞杂交）。（4）是植物基因工程的理想受体，用外源遗传物质对植物原生质体进行改造和转化，然后诱导分裂、分化再生出能育的完整基因工程植株。（5）也是研究细胞生物学、分子生物学、体细胞无性系变异和植物病理学研究的有用工具。自1970年首次获得原生质体再生植株成功以来，通过原生质体获得再生植株的植物约有280余种，其中有20种为我国首先报道。原生质体培养包括原生质体的分离、培养、植株再生等过程。(一)原生质体的制备：1、材料来源与预处理：（1）材料来源：可以采用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。（2）预处理：A.预质壁分离：17-20℃酶液中静置半小时，再于28—34℃保温，或将材料置于与酶液中糖浓度相同的溶液中预培养1h左右，再浸于酶液中消化即可达到质壁分离目的；B.预培养:将除去下表皮的叶片于诱导愈伤组织培养基上培养7天，再用酶消化去壁，所得原生质体分裂频率较高；C.暗处理:将室温下生长5—7个星期的植物材料在黑暗中放置30h以上，取其叶片制备的原生质体有活力；D.光处理:将叶片于日光或灯光下照射2—6h令其萎蔫，利于撕除下表皮及原生质体分离；E.低温处理:夏季应用的实验材料其萌动种子应于4℃过夜后再播种，从其植株叶片上分离的原生质体培养效果较佳。2.制备原生质体的酶类：高等植物细胞壁主要成分为a-纤维素，其次为半纤维素、果胶质及蛋白质。细胞生长的不同阶段及不同物种的细胞壁组成与结构不同，木质化及次生加厚的细胞壁不被酶消化，故选择消化细胞壁的酶类是制备原生质体关键。（引自K.-H.Neumannetal.,PlantCellandTissueCulture-AToolinBiotechnology,PrinciplesandPractice,©Springer-VerlagBerlinHeidelberg2009）常用的酶类有：A.纤维素酶（Cellulase），如OnozukaR—10及RS，国内常用的为EA3—867，其中含少量果胶酶；B.果胶酶（Pectinase），如MacerozymeR-10又叫离析酶，主要含果胶酶，活力较高，其含杂酶较多，用量不超过2％，作用时间长有毒害作用；此外亦用PectalyaseY—23，也叫离析软化酶，活力极高，叶片用量一般为0．1％，悬浮细胞为0．05％；C.崩溃酶（Driselase)，为一种粗酶制剂，具有纤维素酶及果