生物分析课件

生物分析[e-mail]2现代化学的发展趋势生命科学研究的关键是分析技术的提高材料科学化学生命科学3生命的组成无机物有机物气水矿物质糖类肽、蛋白质脂类核酸O2,CO2,NO,等各种常量和微量元素单糖、多糖、核糖蛋白质、酶、多肽脂肪、固醇DNA、RNA、核苷生命科学中的化学问题4生命基本活动生物氧化还原(能量代谢)信号转导神经传递生命活动中的化学药物代谢ADME/T—Absorption,Distribution,Metabolism,Excretion./Toxicology5生物大分子的结构生物分子间的相互作用生物反应过程的中间体药物与生物大分子的相互作用生命活动中的分析化学6课程安排绪论2生物大分子纯化技术6核酸分析2糖分析2蛋白质分析2酶法分析4免疫分析67专题报告细胞凋亡与凋亡分析方法研究进展质谱在生物分析中的应用进展电化学技术与生物分析要求：用自己的语言进行文献综述按照正规标注方法标注出相应的参考文献，标注格式为：作者(中文作者全名，英文作者姓,名第一个字母；前三位作者，后面作者用等或et.al).文章题目，刊物，年，卷，期：页码。全部参考文献格式应该统一。如：SackstederCA,QianWJ,KnyushkoTVetal.Endogenouslynitratedproteinsinmousebrain:linkstoneurodegenerativedisease.Biochemistry.2006,45(26):8009-8022.不得少于3000字成绩评定8第一章概述1、定义生物分析化学是以分析化学理论、技术手段和方法为基础，以生物化学和分子生物学理论与技术为补充，以数学、物理学和计算机技术为手段，量测并获取生物/化学信息的前沿性交叉学科。9任务生物活性物质的组成、含量、结构、形态等方面的信息；发展获取上述信息的方法以及复杂生物物质的分离和纯化技术；创制用于研究生命活性物质间相互作用的技术手段。10生物分析化学特点A、生物分析化学研究的对象是生命活性物质，它既包括核酸、蛋白质等大分子，又含有种类繁多的活性小分子和调控分子；B、研究手段方面独特，生命体内的活性物质结构复杂、化学性能相似、生物活性各异，并且在生理条件下相互关联，对它们的分析测试常常要求是非破坏性的原位、活体分析；11C、细胞是生物体的基本单元，生命活性物质在细胞内存在并随着空间、时间和外界刺激而运动和变化，因此生物分析化学必须研究微环境和时空中的多维信息。D、生命过程研究需要同时获取大量各类分子相互作用的生化信息，因此，高速、高通量分析方法显得尤为重要。生物分析化学特点122、分类按分析化学习惯分类化学分析法:滴定分析法和重量分析法仪器分析法:光学分析法、电化学分析法、色谱分析法、质谱分析法和热分析法等13按分析方法使用功能分类分离分析结构分析定量分析等14分离分析定义：将复杂的生物体内物质分离成单一组分或组组分的一类方法，它主要包括电泳、色谱技术等。特点：综合多种技术手段将分离与分析有机地结合在一起，避免间歇性操作，缩短工作时间，提高单位时间内的工作效率。15结构分析定义：是通过合适的结构分析技术表征出生物分子中各基本组成单元的排列顺序和空间排布的位置。常用方法：一类是测定溶液状态下的分子构象，此类分析多用波谱分析法，如核磁共振法、圆二色谱法、激光拉曼光谱法、荧光光谱法、紫外光谱法等。另一类是测定分子的晶体结构，如X-射线衍射分析法和小角中子衍射法。16定量分析特点：由于样品量小，被测组分含量极微，因此需要选择灵敏度高、准确、快速和简便的测定方法；同时不少生物物质具有近似的功能团，其测定方法要求突出高度的专一性。常用的测定方法主要有：光谱法（含紫外-可见光谱、荧光光谱等），电化学方法，生物活性检测法，免疫分析法和生物传感器等类别。近年，定量分析方法朝着将分离与分析融为一体的快速仪器分析方向发展，如配备有高灵敏度检测器的芯片技术。173分析特征生物物质种类繁多，各类物质的分析也各有其特点。我们主要讨论蛋白质、核酸的分析特征。从适合分析的角度看，蛋白质、核酸等生物大分子主要表现为生物活性、光学活性、电化学活性和分离特征。18a.紫外-可见光吸收特性核酸核酸中含有氮等杂原子组成的嘌呤和嘧啶环，其杂环共轭体系能够产生π-π*跃迁并吸收260~290nm波段的紫外光。其中，260nm附近的强烈吸收而显示其特征峰，因而常作为定量测定核酸（DNA）的依据。同时，这一特征可以用于测定核酸体系的结构稳定性。19实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值，因为蛋白质的最大吸收在280nm处，因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。紫外-可见光吸收特性20蛋白质蛋白质含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸等芳香环基团，其环状结构可以产生π-π*跃迁，因而大多数蛋白质在280nm处有最大吸收峰。紫外-可见光吸收特性21b.红外光谱红外光谱主要是用于研究配体的结合和氢键相互作用，并在特定的环境中探测分子的构象。核酸的红外光谱特征主要表现在其杂环基团的振动，如嘧啶环。蛋白质的红外光谱是肽键、侧链基团、二硫键等的不同振动方式所致。22c荧光特性荧光技术是一种高灵敏度的分析测试方法，其质量检测限可达到10-12g，利用此技术可检测超痕量的生物活性物质，是目前生物分析中研究最多、应用最广的方法之一。同时，由于荧光发射的时间极短，可用来研究生物分子的反应动力学，跟踪反应和分子重排过程。23核酸核酸的内源荧光很弱，不能直接利用荧光技术研究核酸的结构与性质。常用的方法有荧光衍生法和小分子荧光探针增强法。荧光特性24蛋白质在蛋白质分子中，能发射荧光的氨基酸有色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及苯丙氨酸(Phe)，个别蛋白质分子含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)也能发射荧光。Trp残基对微环境的变化很敏感，并且大多数蛋白质中都含有不同种类的Trp残基，因而常作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。荧光特性25d.核磁共振谱特性核磁共振谱(NMR)是研究1H、13C、19F、31P等核素的核自旋的有效手段，它通过测量核素对不同频率辐射的吸收峰（化学位移）、谱线数目及其距离（偶合常数）和激发态的寿命（弛豫），来表征物质的存在环境。生物学研究中，NMR主要用于研究pH值对分子生物学过程的影响以及特定残基的pKa值；监控生物分子的反应动力学过程；在高浓度和pH及温度恒定的条件下，也可以测定生物大分子的结构。NMR法研究蛋白质主要是通过对活性质子、配位微环境和疏水内核的检测来进行的。26e.电化学特性生命过程永远伴随着电荷运动，因此生物电化学和生物电分析化学是探讨生命化学的基础。利用电分析化学的原理和实验方法，不但在生命体和有机组织的整体水平上，更重要的是在分子水平上研究或模拟带电粒子在生物体系或相应模型体系中的分布、传输、转移和转化的化学本质和规律。27DNADNA分子的电活性主要是由DNA碱基所引起的。DNA碱基有鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)，其中，T不会发生电氧化或电还原；G、A、C可在电极上发生电还原，其还原位点主要是G的N-7位，A的N-1位，C的N-3位。G和A又可在电极上电氧化，其氧化位点主要是G的C-8位，A的C-2位。DNA中G、A的氧化不涉及到氢键，而A、C的还原需要破坏碱基间的氢键。NNNNHNH2腺嘌呤NNHNNHO鸟嘌呤NH2NHN胞嘧啶ONH2NHNH胸腺嘧啶OO。28蛋白质除直流极谱法外，电化学方法过去很少用于蛋白质分析。其主要原因在于表面对蛋白质有强烈的吸附，即使是10-7mol/L的稀溶液也是如此。吸附的结果影响电极对分析物的响应。电分析化学方法可以研究蛋白质的变性(denaturation)-复性(renaturation)和跟踪重金属离子与蛋白质配合物形成的过程；同时也可提供许多有价值的参数，如由直流极谱法获得的吸附参数；确定蛋白质和金属离子之间相互作用相关的配合特征。29f.分离特性各种生物分子共存于细胞这一基本结构单元中，研究生物大分子结构与功能的首要任务就是采取有效的手段将它们逐个分离或组分离，其基本要求是有一定的效率、速度、收率和足够的纯度，并且要求分离后的物质要保留它们原有的生物学活性和化学完整性。30外观特征：指的是分子大小、密度和形状电性：带电荷是蛋白质、核酸等生物大分子的共同特征，其净电荷取决于分子中各个基团所带电荷的总和。溶解性能：是指由于蛋白质、核酸等生物大分子的组成和结构不同所导致的在不同溶剂和溶液条件下的溶解度差别。特异结合性能：如蛋白质可特异性结合其抗体主要运用于分离的特性31“茶水尿”事件2007年3月浙江电视台记者为了对部分医院的“院风”进行调查,采用了暗访的方式到杭州一些医院,把茶水当做尿液的样本送到10家医院检测。结果竟然有6家医院化验结果表明送检“标本”出现异常,给出的化验结果导致临床医师认为患者泌尿系统“发炎”,并根据这一结论,有5家医院开出消炎药,总计药费1300元人民币左右。32尿液检验原理尿液潜血（红细胞）分析试纸的反应原理是利用血红蛋白中的亚铁血红素的假过氧化物酶活性催化分解过氧化物，产生新生态的氧，进而氧化指示剂，使指示剂显色，从显色的强度可以得知尿液中血的浓度。尿液中白细胞测定的反应原理是利用中性粒细胞内酯酶催化水解吲哚酚酯水解，产生游离酚，游离酚氧与试纸中的重氮盐偶合而显紫色。茶叶水中的物质及其复杂，主要包括有水、蛋白质、氨基酸、咖啡因、多元酚类、碳水化合物、脂质、矿物质、植物色素、维生素、挥发性成分、有机酸等等。有些茶叶由于环境污染，其含有的杂质就更数不胜数，只要是有氧化性，能产生新生态氧，就能使指示剂氧化，使指示剂显色，产生假阳性反应，而那些酚类及其他有机物，只要能与试纸中的重氮盐发生偶合反应，就都可以产生假阳性反应。也许有人会说尿中的各种成分不也很多吗？但是尿液检测专用的试纸在设计的时候就已经考虑到了这些干扰，因而影响不大。同样的道理，由于茶水中的有形成分（如尘埃、碎屑、悬浮微粒、茶碱结晶体等）也很多，很容易就会造成一些尿沉渣分析仪报出错误的结果。334生物样品的提取与纯化34DNA和蛋白质等生物分子在生物体内以复杂形态存在，或者与众多的无机/有机化合物形成复合物，或者自身组合在一起，并且被抽提的材料不同而它们有明显的差异，加之含量低、离体后稳定性差，因此在分析之前必须对生物样品进行提取、纯化等预处理。取样35样品提取的一般步骤材料的选择与处理细胞的破碎有效组分组的抽提粗品的纯化36参考文献申泮文主编，化学生物学与生物技术，科学出版社，2005李元宗，常文保编著。生化分析，2003高鸿主编，分析化学前沿，科学出版社，1991汪尔康，21世纪的分析化学。科学出版社199937一般来说，核酸的双螺旋是由于分子中的氢键和碱基堆积相互作用所导致，当升高温度就可以减弱它们的相互作用并破坏其双螺旋结构，并且随着温度的升高260nm处的吸光度随之增大。在温度引起的变化中，吸收的改变作为温度的函数进行测定。这种热变性相当于单向性晶体的熔化过程，熔解时产生增色作用。当DNA变性时吸光度达到增加值1/2时的温度，叫做熔链（解）温度，以Tm表示。Tm随着鸟嘌呤和胞嘧啶的含量升高而增加，可用此法测量核酸中G-C的百分含量，作为核酸的特征之一，已成为生物分类的一项重要依据。38三种氨基酸的近紫外吸收带(pH为6时)，苯丙氨酸λmax为257nm，ε＝200L.mol-1.cm-1；酪氨酸λmax为275nm，ε＝1300L.mol-1.cm-1；色氨酸λmax为280nm，ε＝5000L.mol-1.cm-1。用此特征吸收，可以粗略地计算蛋白质的含量。同时，由于肽键的存在所有蛋白质均可吸收230nm以下的紫外光。39荧光衍生法是将荧光物质或荧光基团经化学衍生反应修饰到核酸上，再用荧光分光光度计检测其荧光强度变化