分子实验报告

分子生物学基础实验报告[文档副标题]姓名：贺选班级：生信基地1101学号：U2011125922013-9-3分子生物学基础实验分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringentcontrol）和松弛控制型（relaxedcontrol）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColEⅠ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。本实验分离提纯化的质粒pBR322、pUC19就是由ColEⅠ衍生的质粒。所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalentlyclosedcircularDNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（opencircularDNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。二、实验目的1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。2．了解制备原理及各种试剂的作用。三、实验材料和试剂材料：大肠杆菌E.coli，含pET-28质粒。试剂：1.LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，用NaOH调pH至7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。2.溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA。灭菌后存放。3.溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）：预先配制1％SDS母液，临用前一天晚上加入0.2mol/LNaOH，4℃保存。（不要SDS和NaOH一起配，这样4℃条件下SDS会析出使溶液浑浊）4.溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）：5mol/L乙酸钾60mL、冰乙酸11.5mL、双蒸馏水28.5mL。（冰乙酸要在通风橱里面加，配好后要严格测定其pH值）5.酚/氯仿液(V/V＝1/1)：酚为重蒸酚，配制时，先将氯仿中加入异戊醇，使其体积比为24:1，然后等量的加入重蒸酚，混匀，并用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，于棕色瓶中存放，并在上面覆盖等体积的0.01mol/LTris-HCl(pH7.6)，4℃保存。（配制酚/氯仿时要小心，不要洒出来，也不要溅到手上，用过的枪头要迅速的换掉，避免污染。取用时，要取下层！）6.无水乙醇7.70％乙醇8.pH8.0TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl、1mmol/LEDTA，其中含RNA酶20μg/mL。仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。关于微量移液器的操作：1)将微量移液器按钮轻轻压至第一停靠点；2)垂直握持微量移液器，将吸嘴浸入液面下几毫米，不要插入到液体底部；3)缓慢，平稳的松开控制按钮，吸上样液。千万不要松的太快；4)等一秒钟后将吸嘴提离液面；5)平稳的把按钮压到第一停靠点，再把按钮压到第二停靠点以排出剩余的液体；6)提起微量移液器，让吸嘴轻轻靠容器内壁，松开按钮；7)剔除吸嘴。四、操作步骤（一）培养细菌将带有质粒pET-28的大肠杆菌接种在含50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。注意：添加Kan时，须待LB培养基冷却到50℃左右方可加入。接种操作：1)首先准备好10ul量程的移液枪，枪架，70%酒精和棉球，镊子，枪头盒子（灭过菌的，含枪头）还有Ep管架，放到超净工作台，打开紫外灯灭菌20-30min.2)关掉紫外灯，把装有10mlLB培养基的锥形瓶，菌液（菌种：pET-28）和卡那霉素放到超净工作台上，点燃酒精灯。3)用酒精棉球擦拭双手以及超净台面（若枪，枪架，枪头盒子等未在酒精灯下灭菌则使用前要用酒精棉球擦拭）。4)拆掉装培养基的锥形瓶的棉线，打开棉塞，将瓶口和棉塞置于酒精灯上方作灭菌杀毒处理，迅速盖紧棉塞。把移液枪的量程调到10ul，用酒精棉球轻轻擦拭枪管，甩干酒精，取枪头时，手侧面打开枪头盒子，迅速取出枪头并顺手关好盒子，注意手不能碰到枪头。5)取10ul卡那霉素，注意取的时候，用大拇指顶开pE管的盖子，不要让手接触到管口内。取完后，迅速加入到锥形瓶内，注意加的时候，拿枪的那只手的食指和中指的根部夹紧棉塞，并且棉塞和锥形瓶口不要离开火焰太远，枪头要始终朝下。加完剃掉枪头。6)调节枪的量程到2ul，按上述方法取2ul菌液，加入到锥形瓶内，剃掉枪头，枪归还到架子上，然后包好锥形瓶，做好标记。7)清理好超净工作台。把接种好的菌放在摇床上培养过夜。（二）从菌落中快速提取制备质粒DNA1．取1.4mL菌液置于1.5mLEp管中，10000rpm离心1min。2．弃上清，加入150μLGET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。3．加入200μL新配制的0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。4．加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。5．在4℃下，10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mLEp中，如上清液浑浊则需重新离心一次。6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mLEp管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置3min。用离心机于12000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。8．用0.5mL70％乙醇洗涤沉淀一次，10000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。9．用25uL含无DNA酶的胰RNase(20ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存，供下午电泳使用。贮存于-20℃备用，可长期保存。五．质粒的检测1.制琼脂糖凝胶（详细内容见下节）；2.取1ulloadingbuffer和9ul上述提取的质粒，混合均匀后加样；3.在60V的电压下，跑胶50min(距胶板末端1~2cm处)，关闭电源，取出胶块放到EB中染色20min;4.取出后，在蒸馏水中清洗后，拿到凝胶成像仪下观测图谱；5.图谱结果：12345M781.翟天龙2.贺选3.徐鸿琛4.程锦明5.李墨6.Marker7.胡慧8.张良春质粒电泳图由上图可以清楚的看到，位于marker的第三条带对应的位置有带存在，说明质粒提取成功。六、注意事项1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl(pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液，因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含有蛋白质等杂质。6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。7．有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次移接有可能造成质粒丢失。因此不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。七、思考题1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？答:要防止剧烈的震荡破坏质粒，并且防止细菌DNA裂解混入质粒。2．质粒的基本性质有哪些？答：是一种能进行自主复制的双链环状DNA，可遗传给子代；常常携带有抗性基因；质粒融进细胞之后可以整合进细胞的染色体，随细胞一起复制翻译，也能从细胞中游离出来而成为独立的DNA分子。3．碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？答：溶液Ⅰ（50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl,pH8.0）中，葡萄糖的作用是使悬浮的大肠杆菌不会快速的沉积到管底；EDTA是用于抑制DNase的活性。缓冲液则用于控制溶液的酸碱性和渗透压。溶液Ⅱ（0.2MNaOH/1%SDS）中，NaOH的作用是使细胞破裂，使细胞膜崩解。SDS则是用于共沉淀蛋白质和基因组DNA。溶液Ⅲ（3M醋酸钾/2M醋酸）中，醋酸钾是用于置换SDS中的Na，形成PDS沉淀，从而使蛋白质和基因组DNA沉淀而除去。醋酸是用于维持溶液酸碱性避免溶液pH过高。4．抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？答：首先，用物理的或者化学的方法使细菌细胞破裂，加入蛋白酶，醋酸盐沉淀或者酚/氯仿抽提，除掉蛋白质；其次，加入SDS和醋酸钾，也可除去蛋白质和基因组DNA；然后加入RNase酶除掉RNA。5．如何提高质粒DNA的产量？答：增加菌液的量或浓度，多次离心一次收集6．为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么