紫杉醇的生物合成

L/O/G/O紫杉醇的生物合成背景介绍紫杉醇是目前临床上最畅销的抗恶性肿瘤药物。其特点是广谱抗癌。现为治疗卵巢癌和乳腺癌的一线药物，对铂类等已有抗药性的顽固性卵巢癌亦有效。此外，紫杉醇对肺癌、食管癌、膀胱癌、头颈部癌、黑色素瘤、结肠癌和HIV引起的卡波济肉瘤也有效。人们已在紫杉醇结构基础上进行侧链改造，得到了多西紫杉。化学合成紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架和桥头双键以及众多的含氧取代基。先后共有30多个研究组参与研究其全合成，经20多年的努力，于1994年才由美国的R．A．Holton与K．C．Nic~aou两个研究组同时完成紫杉醇的全合成。随后，S．T．Danishefsky(1996年)、P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年)和Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这一工作。•半合成方法一般以其前体10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ为原料，延长边链而成。另一种半合成方法是以10-去乙酰巴卡亭Ⅲ为前体物来合成。化学合成的缺陷合成路线复杂，反应条件难以控制，产率低。用到了剧毒的原料，仅限于实验室水平，很难进行工业化生产。半合成中的前体脱乙酰基浆果赤霉素仍是从红豆杉中提取。从红豆杉中提取•紫杉醇在植物体内的含量相当低，目前公认含量最高的短叶红豆杉树皮中也仅含0．069％•资源很匮乏•红豆杉生长缓慢，树皮剥去后不能再生，树木将死亡红豆杉怀璧获罪由于美国、加拿大等国家对红豆杉立法保护，药源地转向了中国等国家。在中国，８０％的红豆杉集中在云南，而且云南红豆杉的紫杉醇含量最高。１９９３年，民营企业云南汉德公司成立，其主要业务是从红豆杉中提取紫杉醇。１９９５年，汉德公司依靠中科院昆明植物研究所的技术，建成了中国最大的年生产能力５０公斤的紫杉醇及其系列产品生产线。１９９９年２月，该厂的产品还通过了美国ＦＤＡ认证，“顺利扫清了通向美国市场的障碍”。云南省人民政府生物资源开发创新办公室的资料说，汉德公司的紫杉醇年出口量为２０—３０公斤（１公斤紫杉醇需用树皮１５—３０吨）。目前，中美合资的汉德生物技术开发有限公司已被云南省列为生物资源开发、出口创汇的骨干企业，备受各方重视。２０００年底，该公司与美国签订了价值６亿多元的供货合同。在中国，获得紫杉醇产品开发权的还有北京协和制药厂。从1992年到2001年，将近10年时间，云南红豆杉遭到了毁灭性的破坏，分布在滇西横断山区中的300多万棵红豆杉，绝大部分被剥了皮（有调查数据认为是92.5%），现正在慢慢死去。工艺过程•红豆杉外植体的处理：用自来水充分洗净，再用70%乙醇冲洗表面后切成小块，在70%乙醇中浸泡2分钟，再转移至0.1%升汞溶液中浸泡20分钟，然后用无菌水冲洗4到5次，备用。•愈伤组织诱导及培养：将上述无菌红豆杉嫩茎小块组织接种于含2ppm的2，4-D、0.5ppm的KT及10%椰乳的MS培养基中，于25摄氏度的二氧化碳培养箱中培养40天，PH5.8,即可形成小的愈伤组织块，然后每隔30天进行一次移植继代培养。每次移植继代培养均取一块愈伤组织，不另其混杂，如此多次移植继代培养即可获得多个愈伤组织无性系。工艺过程•细胞悬浮培养：培养基为含1ppm的2，4-D、0.05ppm的KT及10%椰乳的B-5培养基•红豆杉细胞大量培养：培养基与悬浮细胞培养基相同。在反应器中加入培养液，灭菌后冷却至室温，接种已经培养30天的悬浮培养细胞，接种量按干细胞1到2克每升，在25摄氏度下，培养30天，待收获细胞。•细胞干燥及收集：每批细胞培养30天后，离心或过滤收集细胞，用去离子水洗涤两到三次，每次抽干，然后于30至40摄氏度低温下真空冻干，即得红豆杉培养细胞成品。超临界提取,然后经己烷脱脂,氯仿萃取2.HPLC3.梯度洗脱真菌发酵发现历史：•1993年，美国蒙大拿州立大学的植物病理学家Strobel和化学家Stierle在短叶红豆杉的韧皮部中发现了一种内生真菌，它能够自主产生紫杉醇。•1996年，从西藏红豆杉小枝的内皮层中分离得到的内生小孢拟盘多毛孢，实验证明它能产生紫杉醇。•后来，人们发现从美国南卡罗来纳州柏树的树皮中获得的小孢拟盘多毛孢、一种土生茜草科植物中分离得到的内生真菌也能产生紫杉醇•我国科研工作者在东北红豆杉、南方红豆杉、云南红豆杉中均找到产紫杉醇的真菌•但问题是：这些菌株的产量实在太低……内生真菌生产紫杉醇的优势•生产的可重复性，在工业上可用发酵罐大规模进行生产，内生真菌生长迅速，易于培养，生产周期短。•微生物能在简单的培养基上生长，应用的培养基相对比较便宜，在收集紫杉酵之前，可以通过改良培养环境、改进技术来提高产量。•微生物育种和选育速度会明显高于植物细胞株。•增加微生物的生产能力比较容易，微生物易于通过基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量。•药厂利用微生物规模化发酵生产的技术比较成熟，其培养与发酵条件相对易于控制和掌握，即微生物发酵法生产紫杉醇的转产风险明显小于细胞培养法与化学合成法。内生真菌的分离•将植物材料用70％酒精进行表面彻底消毒，风干后，用无菌刀片切除外部组织，将修整好的内部组织放在水琼脂培养基上，经过一段时间的培养后，真菌便生长出来。•然后，将分离出的内生真菌菌丝尖端转移到马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，室温培养至少10d，检查真菌培养平板，不断纯化，最终获得纯种的内生真菌，同时立即放入含15％甘油中，-70℃保存，以备发酵使用。内生真菌培养•内生真菌在PDA琼脂培养基中不易产生孢子，因此，需将真菌接种在水琼脂培养基中的香石林叶片上，23℃，1至2周后即可出现暗色的成熟孢子。•然后，将含菌丝体的琼脂块接种在2L锥形烧瓶(含500mLPDA培养基)中，23℃培养。紫杉醇的分离•培养一段时间后，将全部培养物过滤(为了降低可能污染紫杉醇的脂肪酸含量，可在摇瓶中添加适量的碳酸钠)，培养液用等体积的次氯酸提取，有机相35℃减压蒸干，残余物再用次氯酸盐溶解，硅胶柱进行阶段洗脱。高速逆流色谱(HSCCC)：采用4个成分(正已烷一乙酸乙酯一乙醇一水)双相溶剂系统，通过两步即完成分离，产物纯度可达85％----95％。紫杉醇的纯化添加合成紫杉醇的前体物添加代谢产物合成抑制剂寻找特殊的真菌调节剂提高真菌产紫杉醇产量！构建基因工程菌植物和真菌合成紫杉醇的途径不尽相同，不同真菌合成的前提也不尽相同。紫杉醇的三环二萜骨架来自经甲基戊酸，乙酰基来自乙酸，而C13位酯基侧链来自苯丙氨酸，因此向培养基中加入甲基戊酸、乙酸钠、苯丙氨酸可以可以提高紫杉醇产量。文献报道还有人用苯甲酸钠和邻苯二酚。添加合成紫杉醇的前体物真菌的次级代谢产物丰富多样，如果弄清楚紫杉醇与其他次级代谢物合成之间的关系，对于人为抑制其他次级代谢物的合成、促进紫杉醇的生物合成具有重要意义。常用的抑制剂有麦角甾醇、戊唑醇。添加代谢产物合成抑制剂在许多微生物与植物的互作体系中，宿主植物中某些极微量的化合物对微生物产生目的产物是必不可少的，它可启动微生物中的某些遗传功能，从而促进某些产物的合成。因而可考虑在培养基中添加红豆杉的树皮或针叶等，有可能刺激真菌产紫杉醇产量的提高。此外在真菌不同的发酵时问加入不同的糖类，同样可以提高紫杉醇的产量。寻找特殊的真菌调节剂红豆杉与真菌之间可能存在一种生物体内遗传交换的分子机制，即基因与基因之问相互交换，当然内生真菌也可能有其独立的产生紫杉醇的系统，这些都有待进一步研究。随着对紫杉醇产生菌的生物合成过程更深入的阐明及相关酶基因的克隆与表达，对其进行基因改造，构建高产紫杉醇的内生真菌的工程菌株，可以提高紫杉醇的产量。相信不久，利用基因工程生产紫杉醇将成为可能。构建基因工程菌L/O/G/OThankYou!