干扰素

第十三节基因工程药物制造实例干扰素（interferon，IFN）是人体细胞分泌的一种活性蛋白质，具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性，是人体防御系统的重要组成部分。根据分子结构和抗原性的差异分为α、β、γ、ω等4个类型。α型干扰素在分为α1bα2aα2b等亚型。广谱抗病毒活性（rhuIFNα）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；疱疹、病毒性角膜炎。直接抗肿瘤活性（rhuIFNα）􀀹毛细胞和慢性髓样白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫调节活性——治疗慢性肉芽肿瘤（rhuIFNγ）多发性硬化症rhuIFNβ2、重组干扰素的临床应用体外诱生干扰素制备工艺：Sendai病毒诱导人白细胞3、干扰素生产工艺路线（1）1989年：IFNα-n3/Alferon，批准上市产量低：1gIFNα，需要3亿ml人血白细胞来源困难，工艺复杂，收率低，价格昂贵潜在的血源性病毒污染的可能性人源转化细胞系培养生产工艺：3、干扰素生产工艺路线（2）1999年：IFNα-n1/Wellferon,批准用于临床。优点：首次实现大规模商业化生产。缺点：活性低，退出临床应用。基因工程大肠杆菌发酵生产工艺：3、干扰素生产工艺路线（3）上市产品：重组人干扰素rhuIFN􀀹1986，rhuIFNα-2a，rhuIFNα-2b；􀀹1990，rhuIFNγ-1b；1993，rhuIFNβ-1b；􀀹2001－2002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表达产物：无糖基化，N-met，无活性包涵体工艺特点：发酵过程，随后变性、复性过程。3、干扰素生产工艺路线（4）动物无限细胞系培养生产工艺：上市产品：rhuIFNβ-1a􀀹1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表达产物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工艺特点：分泌表达，产量低，成本高,过程严格中华仓鼠卵母细胞宿主：腐生型假单胞杆菌（Pseudomonasputida）上市产品：IFNα-2b/安福隆表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性工艺特点：􀀹发酵周期短：几个小时􀀹无需变性、复性过程，获得有活性产品3、干扰素生产工艺路线（5）1、基因工程假单胞杆菌菌种建立2、菌种库的建立与保藏3.1基因工程假单胞杆菌的构建与保藏第一步：干扰素α-2b基因的克隆P73图2－131、基因工程菌菌种建立诱生的白细胞提取全RNA通过寡dT-纤维素柱获得寡A的mRNA蔗糖密度梯度离心提取12s的mRNA逆转录成cDNA双链cDNA接上dT或dG尾pBR322质粒pBR322质粒DNA的PstI酶切割加上dA或dC退火获的杂交质粒转化大肠杆菌第一步：干扰素基因的克隆(RT-PCR)制备白细胞，病毒诱导，分离mRNA,反录酶合成cDNA,PCR，基因连接质粒,转化E.coli,筛选鉴定克隆。测序：编码人IFNα-2b基因序列,501bp，165aa。1、基因工程假单胞菌菌种建立ATGTGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTGGGTAGCAGGAGGACCTTGATGCTCCTGGCACAGATGAGGAGAATCTCTCTTTTCTCCTGCTTGAAGGACAGACATGACTTTGGATTTCCCCAGGAGGGTTTGCCAACCAGTTCCAAAAGGCTGAAACCATCCCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGATCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGACTCATCTGCTGCTTGGGATGAGACCCTCCTAGACAAATTCACACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTCGAAGCCTGTGTGATACAGGGGGTGGGGGTGACAGAGACTCCCCTGATGAAGGAGGACTCCATTCTGGCTGTCAGGAAATACTTCCAAAGAATCACCTCTATCTGAAAGAGAAGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTTTCTTTGTCAACAAACTTGCAAGAAAGTTTAAGAAGTAAGGAATGA第二步：表达载体构建IFN基因与表达载体连接转化大肠杆菌筛选阳性克隆获得序列正确表达载体1、基因工程假单胞杆菌菌种建立第三步：工程菌构建转化假单胞菌筛选高表达、稳定遗传的工程菌获得原始菌种1、基因工程假单胞菌菌种建立2、菌种库的建立与保藏品质控制（QC）：菌种特性、生产能力、质粒稳定性菌种检查合格后，方可投产。3.2干扰素的发酵工艺过程取保存工作种子批菌种，室温融化摇瓶培养：30℃，pH7.0，250r/min，18±2h检测：OD值和发酵液杂菌检查。1．摇瓶培养接种：接入50L种子罐，接种量10%。培养：30℃，pH7.0。控制：级联调节通气量和搅拌转速溶解氧（DO）为30%，3～4h，OD4.0。检测：显微镜和LB培养基划线检查，控制杂菌。2．种子罐培养接种：通入300L培养基的发酵罐，接种量10%。控制：级联调节通气量和搅拌转速。前4h：30℃，pH7.0，DO为30%。4h后：20℃，pH6.0，DO为60%，5～6.5h。终点控制：OD值达9.0±1.0，5℃冷却水快速降温至15℃以下。检测：发酵液杂菌检查3．发酵罐培养连续流离心机：冷却的发酵液，16000r/min离心收集。菌体保存：－20℃冰柜，不超过12个月。检测：干扰素含量、菌体蛋白含量等。4．菌体收集3.3干扰素的分离纯化工艺过程菌体裂解、加絮凝剂和凝聚剂得粗干扰素溶解粗干扰素盐析沉淀与疏水层析阴离子交换层析与浓缩阳离子交换层析与浓缩凝胶过滤层析无菌过滤分装3.4质量控制标和要求干扰素鉴别试验干扰素效价测定蛋白质含量，纯度测定，分子量宿主残余蛋白、残余DNA干扰素结构鉴定：紫外光谱，肽谱，N端序列其他：热原，内毒素等干扰素的剂型•冻干粉针剂临床上早期使用的、世界上应用最广的一类干扰素制剂,同时它的生产工艺也最为稳•注射剂(水针剂)临床最为常用,主要用于病毒感染性疾病和肿瘤的治疗•栓剂在临床上被用来治疗由人类疱疹病毒和乳头瘤病毒感染引起的宫颈糜烂。•干扰素滴眼剂病毒性角膜炎•喷雾剂可以用来治疗某些病毒性皮肤病;同时它可以喷入鼻腔或口腔,用来预防和治疗某些呼吸系统疾病,如感冒、口唇疱疹、SARS等.复习•1.基因工程药物制备的一般过程。•2.利用基因工程技术生产药品的优点有哪些？•3.获得目的基因常用的三种方法是（）、（）和（）。作业1、表达载体必须具备的条件有哪些？2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？1、质粒不稳定分为哪两类?2、如何解决质粒不稳定性？•对由基因重组技术所获得的蛋白质药物产品进行鉴定时，常做哪些项目分析？答：1.生物活性测定：2.理化性质测定：3.蛋白质含量4.蛋白质纯度分析5.杂质检测6.稳定性考查：7.产品一致性的保证：