基因诊断与产前诊断中常用的分子生物学技术

基因诊断与产前诊断中常用的分子生物学技术张淑杰CommonlyusedTechniques•PCR•聚丙烯酰胺凝胶电泳•DNA测序•MLPA•基因芯片PCR•实验原理•实验步骤PCR实验原理：PCR(Polymerasechainreaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。PCR实验步骤：•变性（Denaturation）将待扩增DNA模板加热，一般变性温度为95℃，双链DNA变性成为单链DNA。•退火（Anealing）两条引物分别与两条DNA的两翼序列特异性结合——复性。退火温度（Tm）与引物序列的碱基组成、长度相关。•延伸(Extention)在适合的条件下，由Taq(或其他)DNA聚合酶催化引导DNA合成，即引物的延伸。延伸的温度一般是72℃，这种热变性—复性—延伸的过程就是一个PCR循环。目的片段的指数扩增PCR反应体系（终体积20~100ul）：•10×PCR缓冲液1/10体积•2mmol/LdNTP1/10体积•引物各10~50pmol•DNA模板10~20拷贝•TaqDNA聚合酶0.2~2.5U•ddH2O补至终体积聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)•实验原理•主要试剂•实验步骤实验原理：聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED)作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应和分子筛效应。当DNA分子进入凝胶，在电场下进行泳动时，可根据各自迁移率的不同而得以分离。分为变性胶与非变性胶两种，区别在于前者中含有一定浓度的变性剂（尿素）。非变性胶可用于双链DNA分子的分离与纯化，变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA分子不同构象对迁移率的影响，常用于进行遗传病家系的单体型分析。变性胶与非变性胶非变性胶用于双链DNA分子的分离与纯化，双链DNA分子在非变性胶中的迁移率与其大小的常用对数值成反比。即越小跑的越快。但其迁移率也受其碱基组成和序列的影响。变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA分子不同构象对迁移率的影响，即DNA在胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。常用于进行遗传病家系的单体型分析。主要试剂：•30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29gN,N’-亚甲双丙烯酰胺1g（非变性胶液）加去离子水至100ml室温避光保存•10%过硫酰铵（APS）：过硫酰铵1g加去离子水至10ml4℃避光保存•TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）4℃避光保存•10×TBE：Tris碱86.4g硼酸55gEDTA（粉末）5.96g加去离子水至800ml高压蒸气灭菌，室温保存•8%丙烯酰胺（含50%尿素）：丙烯酰胺38gN,N’-亚甲双丙烯酰胺2g（变性胶液）10×TBE25ml尿素250g加去离子水至500ml室温避光保存•固定液：无水乙醇50ml冰醋酸2.5ml加一蒸水至500ml•染色液：AgNO31.2g加一蒸水至500ml•显色液：NaOH4g甲醛2.7ml加一蒸水至500mlPAGE实验大体步骤：•制胶（区分胶液及梳齿）•点样（区分上样缓冲液及点样环境）•电泳（区分电压及时间）•固定2min•染色10min•显色至出现DNA清晰条带•胶图扫描银染法显色：原理:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。DNA测序：•实验原理（Sanger法）•实验步骤DNA测序原理：•目前用于测序的技术主要有Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert发明的化学降解法。这两种方法原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一特定的碱基处终止，产生A,T,G,C四组不同长度的一系列核苷酸，然后再变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。在这里主要讲解我们实验室的测序法——Sanger双脱氧链终止法Sanger法测序原理：•每一次测序由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G,A,C,T处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同核苷酸上。可通过高分辨率的变性凝胶电泳分离大小不同的片段。凝胶后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行。脱氧核苷酸与双脱氧核苷酸结构DNA复制是按着5’（核苷酸戊糖的5位碳原子处接着的磷酸基团）向3’（核苷酸戊糖的3位碳原子处接着的羟基基团）方向进行的。在DNA复制过程中起关键作用的酶是DNA聚合酶，该酶只能将游离的核苷酸加到新链的3’端（而绝不是5’端）。因为双脱氧的核苷酸3’端的羟基也脱了氧，所以就不能继续形成3’，5’-磷酸二酯键了，所以新链不能继续延伸，故DNA复制终止于双脱氧核苷酸处。Sanger法测序基本原理示意图：DNA自动测序原理：•PCR体系中含有正常dNTP和四色荧光标记的ddNTP。•ddNTP的3′端为-H，其不能和后续dNTP形成磷酸二酯键，从而终止延伸。•PCR反应中dNTP与ddNTP产生竞争，形成大量不同片断的产物。•PCR产物进行毛细管电泳，根据荧光峰识别每一个碱基。我们实验室基于Sanger法实现的DNA自动测序原理图：DNA测序大体步骤：•测序模板PCR•测序产物纯化——酒精/EDTA/NaAc法•上机毛细管电泳——高分辨率变性胶电泳•数据处理MLPA•实验原理•操作流程•主要优点•技术应用•结果分析（以DMD为例）MLPA实验原理：MLPA是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技术。这一技术最先于2002年由荷兰的SchoutenJP等报道。并非通过PCR扩增样本DNA,而是扩增与DNA靶序列杂交的探针。每个MLPA探针均是由两个寡核苷酸序列所组成，两者特异性地与互补的DNA靶序列结合，且两者结合的位点是毗邻的。在连接酶的作用下，两者连接成为单一的分子。此外，所有的探针均含有序列相同的侧翼序列，因此，使用带有荧光的通用引物即可使其呈指数形式地扩增。在针对某一特定基因的MLPA试剂盒中，probemix含有所有针对不同位点的探针，为所有探针的混合物。但是每一种探针扩增后的片段长度却是独一无二的，从130bp-480bp不等。因此在进行毛细管电泳时，其电泳的速度也会存在明显的区别。只有寡核苷酸与DNA靶序列充分结合后，才能在连接酶的作用下发生连接反应，进而扩增并获得相应探针的扩增峰。如果待检DNA样本与探针结合的靶序列区域存在点突变或者片段的缺失或重复，则探针与其杂交的过程就会受阻，进而影响最后的扩增信号收集。引物x连接部位短探针长探针填充片段引物y连接部位设计探针目的片段11A1B目的片段1多重杂交和连接不匹配探针不连接人工合成的寡聚核苷酸M13转染的寡聚核苷酸毛细管电泳用共同引物x和y对探针进行PCR扩增2A1B1A2A1B2B目的片段22A2BMLPAMlpa技术原理.结果分析引物x结合部位靶特异性序列填充片段引物y结合部位设计探针人工合成的寡聚核苷酸M13转染的寡聚核苷酸1A2A1B2B•每一个探针包含两个寡核苷酸序列，每一个MLPA反应中最多可包含46种不同的探针。•其中一个探针长约40-50bp,为人工合成；另一个探针长约80-440bp,为M13噬菌体转染。•每个M-13噬菌体转染的探针包含一个非杂交的填充片段，该填充片段为探针特异性，即每个探针所包含的填充片段大小不同，决定扩增片段峰值位置。•每对探针在其末端有着相同的PCR引物结合序列。MLPA•探针与靶序列杂交后，通过连接反应，就可形成一个完整的可扩增序列。•每对探针的靶特异性序列与邻近的靶序列杂交，并通过热稳定的连接酶连接。•每对探针只有与其靶序列完全匹配后才能被连接。•样本中靶序列的数量决定了可连接探针的数量。MLPA扩增•连接反应后，所有已连接的探针均可进行PCR扩增•所有探针的扩增只需一个引物对(X和Y)•未连接的探针没有引物连接序列，不能进行PCR扩增反应•特异性的扩增产物数量只与基因目的序列的拷贝数有关MLPA•扩增产物通过毛细管电泳分离和定量。•通过比对对照样本判断目的序列的拷贝数。•每个峰值大小（或面积）表示该目的片段扩增数量在所有扩增片段总量中所占的比值；每个峰的位置由其片段大小决定。片段分析样本对照MLPA操作流程：（1）DNA变性和杂交（2）连接反应（3）PCR反应（4）PCR产物扫描与数据分析MLPA操作流程图：主要优点•所需样本量小，仅需30ngDNA即可完成检测；•可实现多重分析，同时可对46种靶基因位点进行检测；•检测精确度高，能够检测出单个碱基的突变或SNP及基因拷贝数一倍量的增加或减少；•所需仪器简单，只需一个PCR仪和一个电泳分析系统；•耗时短，24h内即可出结果；•自动化程度高；•不同检测试剂盒操作基本相同。；对比其他技术，MLPA能检测的范围更广，小到点突变，大到染色体的缺失和重复MLPA技术应用•用于检测人类基因或基因片段的缺失或重复（如DMD基因诊断及SMA基因诊断等）•用于检测染色体重排•用于检测单核苷酸多态性（SNP)和突变•用于检测染色体三体性•检测肿瘤（甲基化特异性MLPA,MS-MLPA)DMD基因位于X染色体上。在反应中含有一条检测SRY基因的探针，如果是女性，即无此峰。通过与正常男性和女性样品对照样品比较，对应位置没有出现波峰，提示此外显子缺失或男性半合子缺失；如果样品为女性，当该峰值大约为正常女性对照样品的一半或与其他外显子峰相比明显降低，则表示该样品存在此外显子杂合性缺失。同样，波峰增高大致为正常男性的倍数，提示此外显子出现拷贝数增加，为重复突变。一倍为杂合突变，两倍为纯和突变。结果分析（以DMD为例）：DMD45~50号外显子缺失结果图：6699-100.20.40.60.811.21.4X-032.0DMDexon01X-032.0DMDexon02X-032.0DMDexon03X-032.0DMDexon04X-032.0DMDexon05X-032.0DMDexon06X-032.0DMDexon07X-032.0DMDexon08X-032.0DMDexon09X-032.0DMDexon10X-032.0DMDexon21X-032.0DMDexon22X-032.0DMDexon23X-032.0DMDexon24X-032.0DMDexon25X-032.0DMDexon26X-032.0DMDexon27X-032.0DMDexon28X-032.0DMDexon29X-032.0DMDexon30X-032.0DMDexon41X-032.0DMDexon42X-032.0DMDexon43X-032.0DMDexon44X-032.0DMDexon45X-032.0DMDexon46X-032.0DMDexon47X-032.0DMDexon48X-032.0DMDexon49X-032.0DMDexo